材料和试剂

Huh7肝癌细胞（Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank，目录号：JCRB0403）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：12800-017）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：16000-044）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
OptiMEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：31985-062）
500μlOpti-MEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：31985-062）
PEG（USB，目录号：19959）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
聚乙烯亚胺（Polysciences，目录号：23966）
Vent Exo（ - ）聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0257S）
微球菌核酸酶1μl（45单位/μl）（Worthington Biochemical，I.U.B .: 3.1.31.1，目录号：LS004798）
γ-32 P-ATP（PerkinElmer Inc.，目录号：NEG035C）
T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201s）
内标（IS）DNA（来自HBV WT DNA Sac II/Xho I消化的片段）1ng /1μl
2.5mM dNTP混合物（Takara Bio公司，目录号：BH7901）
RNase A（Fermentas，目录号：EN05331）
Tris-HCl（pH8.8）（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
（NH 4）2 SO 4（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
MgSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：230391）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
聚丙烯酰胺（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：10687）
UREA（Duksan Hi-Metal，目录号：CAS 57-13-6）
APS（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
TEMED（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
硼酸（Sigma-Aldrich，目录号：B0394）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
1×含DNA反应缓冲液（见配方）
5％聚丙烯酰胺凝胶（见配方）
5x TBE（请参阅配方）

设备

10cm培养皿（Corning Incorporated，目录号：430167）

软件

Fujifilm Image Gauge软件（4.0版）

程序

Huh7肝癌细胞在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中，在潮湿气氛下，在37℃，5％CO 2中生长。
细胞每三天传代。在转染前一天，将2×10 6个 Huh7细胞接种在10cm皿中。
第二天，使用聚乙烯亚胺（PEI）（共）转染细胞。
PEI转染方法：
1. 在无菌试管中，总共10μg质粒DNA（5μg磷酸受体位点突变体和5μgP缺陷突变体）与500μl混合 Opti-MEM。
2. 加入30微升PEI溶液（1微克/1微升）到DNA-Opti-MEM溶液，然后立即涡旋。
3. 在室温下孵育15分钟。
4. 然后向细胞中加入PEI/DNA-Opti-MEM混合物。
将转染实验重复至少三次。
如先前所述（Kim等人，2004）制备细胞质核心颗粒。
转染后三天，将细胞用于核心颗粒制备细胞质核颗粒制剂：
1. 弃去培养基并用10ml PBS洗涤。
2. 加入PBS 1ml，刮细胞，并转移到1.5ml管
3. 在13,000rpm下旋转10秒并弃去上清液
4. 加入1ml裂解缓冲液，涡旋，然后在冰上孵育10分钟
5. 在4℃下以13,500rpm旋转2分钟。
6. 将上清液转移到新鲜的1.5ml管中
7. 加入微球菌核酸酶1μl（45单位/μl），1M MgCl 210μl（最终10mM），1M CaCl 28μl（最终8mM）。
8. 孵育37℃，1小时
9. 加入40％PEG250μl（26％），5M NaCl100μl（1.4M），0.5M EDTA118μl（40mM）。
10. 将它们放在冰上1小时。
11. 在4℃下以13,500rpm旋转15分钟
12. 将沉淀溶于20μl无核酸酶的蒸馏水中。
为了通过引物延伸分析分析HBV DNA合成，从分离的核心颗粒中提取HBV DNA（Kim等人，2004）。
在引物延伸分析之前，通过Southern印迹分析HBV DNA合成，以观察松弛的环状，双链线性和单链DNA的水平（Jung等人，2014）（图1 ）。

图1.由STSSSS（WT）和突变体C蛋白形成的核心颗粒中的HBV DNA合成为了检查由磷酸受体位点突变体C蛋白形成的核心颗粒中的HBV DNA合成，磷酸受体位点突变体和P缺陷型突变体共转染Huh7细胞。从分离的核心颗粒提取HBV DNA（Kim等人，2004），并进行Southern印迹分析（Jung等人，2014）。指示了复制中间体DNA，松弛环（RC），双链线性（DL）和单链（SS）DNA。

使用T4多核苷酸激酶，寡核苷酸DNA引物在37℃用30μCiγ-32 P-ATP进行5'-末端标记3小时。
标签方法

引物10pmole/ul	2微升
γ-³² P-ATP	3微升
D.W	3微升
10x T4 TNK缓冲区	1微升
T4多核苷酸激酶	1微升

使用5'末端标记的引物HBV1665 +（5'-CTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAAC-3'），HBV1744-（5'-CAGCTCCTCCCAGTCCTTAAACA-3'）和HBV1952-（5'-GAGAGTAACTCCACAGTAGCTCC-3'细长的负链，正链和环化的RC DNA。
将从在10cm皿中从共转染的Huh7细胞分离的核心颗粒提取的HBV DNA（总共20μl）分成四批（5μl）：一批用于Southern印迹，三批用于引物延伸以测量负链，正链和环化RC DNA 对于每个C蛋白变体的引物延伸分析，将5ul病毒DNA加热至95℃5分钟，用1U RNA酶A在37℃处理1小时，乙醇沉淀[乙醇沉淀：向5μl提取的DNA中加入195μl蒸馏水和20μl3M乙酸钠，并通过短暂涡旋混合。加入440μl100％乙醇（分子级），涡旋，并保持在-20℃过夜。通过常规方法沉淀DNA]并重悬于蒸馏水（5μl）中。末端标记的引物用Vent Exo（ - ）聚合酶延伸，产生退火到相应的互补HBV DNA序列的产物（图2）。

病毒DNA	5微升
IS DNA（1ng /μl）	1微升
D.W	7微升
含DNA的反应缓冲液	2微升
2.5mM dNTP	2微升
通风口（ - ）	1微升
标签引物	2微升
总计	20微升

旋转和旋转
95°C 1分钟
95°C 30秒
60℃30秒20个循环
72°C 30秒
72℃1分钟

图2.用于引物延伸分析的寡核苷酸的示意图。使用 P端标记的HBV1665 +，HBV1744-和HBV1952-检测小核和正链DNA延伸和环化。

将5μl来自20μl延伸产物的电泳通过含有8M尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶（1,000电压6小时）。凝胶在凝胶干燥器中在60℃下干燥约30分钟。干凝胶进行放射自显影（图3），并使用Fujifilm Image Gauge软件4.0版测量相对的放射性水平。

代表数据

图3.使用pAd末端标记的HBV1665 +检测到了减数DNA延伸，显示T162A显示减少的负链DNA伸长

食谱

裂解缓冲液
10mM Tris（pH8.0） 1mM EDTA
0.2％NP40
50mM NaCl
1×含DNA反应缓冲液
20mM Tris-HCl（pH8.8）
10mM（NH 4）2 SO 4 4
10 mM KCl
2mM MgSO 4 0.1％Triton X-100
5％聚丙烯酰胺凝胶

30％聚丙烯酰胺 5.2 ml

5x TBE
6毫升

UREA
14.4 g

加蒸馏水至总量30 ml

10％AP
120微升

TEMED
30微升
5x TBE

Tris-Hcl
54克

硼酸
28.5克

0.5 M EDTA
20ml

加入蒸馏水1 L

总计
1000 ml

致谢

这项工作得到了由韩国政府资助的国家研究基金会资助（NRF-2012-R1A2A2A01015370）的支持。我们通过先前描述的方法（Lewellyn和Loeb，2011）进行引物延伸分析，具有微小的修改。

参考文献

Kim，H.Y.，Park，G.S.，Kim，E.G.，Kang，S.H.，Shin，H.J.，Park，S。和Kim，K.H。（2004）。通过在乙型肝炎病毒核心颗粒中引发缺陷型聚合酶来合成寡聚体。病毒学 322（1）：22-30。
Jung，J.，Hwang，S.G.，Chwae，Y.J.，Park，S.，Shin，H.J。和Kim，K。（2014）。磷酸受体苏氨酸162和丝氨酸170和178在乙型肝炎的羧基末端RRRS/T基序内病毒核心蛋白对乙型肝炎病毒复制有多重贡献。病毒核心蛋白对乙型肝炎病毒复制有多重贡献。 88（16）：8754-8767。
Lewellyn，E.B。和Loeb，D.D。（2011）。乙型肝炎病毒核心蛋白的羧基末端结构域的精氨酸簇使多方向的贡献基因组复制。 J Virol 85（3）：1298-1309