Wolff，AC，Hammond，ME，Hicks，DG，Dowsett，M.，McShane，LM，Allison，KH，Allred，DC，Bartlett，JM，Bilous，M.，Fitzgibbons，P.，Hanna，W.，Jenkins， RB，Mangu，PB，Paik，S.，Perez，EA，Press，MF，Spears，PA，Vance，GH，Viale，G.，Hayes，DF，American Society of Clinical，（2013年）。关于乳腺癌中人表皮生长因子受体2检测的建议：美国临床肿瘤学会/学院美国病理学家临床实践指南更新。 J Clin Oncol 31（31）：3997-4013。

Wolff，AC，Hammond，ME，Schwartz，JN，Hagerty，KL，Allred，DC，Cote，RJ，Dowsett，M.，Fitzgibbons，PL，Hanna，WM，Langer，A.，McShane，LM，Paik，，Pegram，MD，Perez，EA，Press，MF，Rhodes，A.，Sturgeon，C.，Taube，SE，Tubbs，R.，Vance，GH，van de Vijver，M.，Wheeler，TM，Hayes，DF ，美国临床协会，O。和美国学院，P。（2007）。美国临床肿瘤学会/美国病理学家大学关于人表皮生长因子受体2检测的指南建议乳腺癌。 25（1）：118-145

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CYG growth pouches (Mega International Inc.)

Concentrated sulfuric acid (Thermo Fisher Scientific, catalog number: A300-212)

Tryptone (BD Bioscience, catalog number: 211699)

Yeast extract (Thermo Fisher Scientific, catalog number: DF0127071)

CaCl₂^.6 H₂O (Thermo Fisher Scientific, catalog number: C79-3)

Agar (Sigma-Aldrich, catalog number: A1296)

CaCl₂^.6 H₂O (Thermo Fisher Scientific, catalog number: C79-3)

MgSO₄^.7 H₂O (JT Baker, catalog number: 2504)

KH₂PO₄ (JT Baker, catalog number: 3246-01)

Na₂HPO₄^.2 H₂O (Sigma-Aldrich, catalog number: S9763)

Fe-citrate (Sigma-Aldrich, catalog number: F3388)

MnCl_2^.4 H₂O (Thermo Fisher Scientific, catalog number: M33-500)

CuSo₄^.5 H₂O (Thermo Fisher Scientific, catalog number: C-493)

ZnCl 2（JTBaker，目录号：4326-01）

（Mallinckrodt，目录号：2549）

（Sigma-Aldrich，目录号：S6646），制备标题化合物，其中R 1，R 2，R 3，R 4， >

TY介质（参见配方）

Fahraeus培养基（见配方）

设备

P5滤纸（Thermo Fisher Scientific，目录号：09-801C）
铝箔
植物生长室

程序

苜蓿种子灭菌
1. 将种子放在15毫升塑料猎鹰管中。偶尔混合，加入3ml浓硫酸5-8分钟
2. 用移液管迅速除去酸，用无菌水洗涤4次
3. 将种子浸泡在10％次氯酸钠中90秒
4. 用无菌水冲洗8次
5. 将种子放在培养皿中的无菌滤纸盘上，并用2ml无菌水浸泡
6. 将种子放在冰箱中，在4°C（黑暗），3 - 5天
7. 将种子移至室温并孵育（在黑暗中）1天以预发芽（1-1.5厘米根长）。
中华根瘤菌菌株
1. 将中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）菌株在含有0.1％初始的TY培养基中生长在30℃下接种至指数生长状态（〜2天）摇动（200rpm）
2. 将培养物以8000xg离心10分钟，并用无菌的0.85％NaCl洗涤一次。
3. 用无菌的0.85％NaCl将培养物稀释至10 7个细胞/ml或OD 600±0.7。
植物生长条件和接种
1. 植物生长袋应用水润湿，并在121℃下灭菌15分钟
2. 每个袋加入来自步骤A7的2-4个预发芽的幼苗植物根通过纸袋托盘中的孔突出。
3. 加入6ml fahraeus培养基。
4. 在25℃，16小时光照条件下，在生长室中生长小袋和21℃下8小时黑暗条件。湿度应在50-70％之间。光条件应为200-350μmol/m 2/s/s
5. 用铝箔覆盖根部，将小袋放入容器中。
6. 1天后用1.0ml悬浮液接种小袋中的幼苗使用无菌移液管在步骤10后立即培养
7. 使用尖角标记标记根尖在生长袋表面上的位置。
结节分析
1. 每天检查袋每个结节的存在和数量厂。记录第一个结节形成的日期和数量结节每日。绘制结节的植物数量（Y轴）以天为单位实验结束。
2. 生长三周后，从生长室中取出小袋。
3. 计数结节，并测量每个结节的距离（以mm为单位）是相对于接种时的根标记。以上结节根尖尖标记被指定为+ mm，而根尖以下标记为 - mm。那些在根尖标记被指定为0mm。情节结节的数量（Y轴）与距根尖标记的距离a 柱状图。那些根瘤菌与大多数根瘤上方的结节尖端标记形成的结节早于那些低于标记的那些认为对结瘤更有竞争力。

代表数据

图1.在生长2周后，用苜蓿中华根瘤菌结瘤的。每天监测植物并在外塑料上标记新形成的结节盖。水平线是接种培养物时的根尖。例如，中间植物中标记为B3的结节是根尖尖标记之上的结节为+ mm，结节B1和B2是根尖尖标记之下的结节为-mm。

图2.带有锡箔内衬容器的Medic瓜牵引器的生长小袋实验顶视图

食谱

TY介质
5克胰蛋白酶
3g酵母提取物
1.3g CaCl 2·6H 2 O或0.87g CaCl 2·sub。 2 H sub 2 O
用蒸馏的H 2 O调至1L，将pH调节至6.9，并通过高压灭菌30分钟灭菌
对于板，加入1.5％琼脂
Fahraeus培养基（Vincent，1970）
0.132g/L CaCl 2
0.120g/L MgSO 4。 7H 2 O 0.100g/L KH 2 PO 4 sub/
2H 2 O O 5 mg/L Fe-柠檬酸盐各自为0.07mg/L的MnCl 2·2 H 2 O·CuSO 4·sup。 ZnCl 2，H 3 BO 3和Na 2 SO 4，其中H 2 O 3，H 2 O 3， /sub>MoO_{4^._{2 H sub 2 O
在高压灭菌1小时之前将pH调节至7.5}}

致谢

本研究得到国家科学基金资助1237993。

参考文献

De Oliveira，L。和Graham，P。（1990）。根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）菌株之间的结瘤和竞争能力速度。 Arch Microbiol 153（4）：311-315。
Bhuvaneswari，T.V.，Turgeon，B.G。和Bauer，W.D。（1980）。由大豆根瘤菌感染大豆（Glycine max L.Merr）的早期事件：I。Localization of infectible root cells. Plant Physiol 66（6）：1027-1031。
Toro，A。（1996）。根瘤菌 - 共生共生中的结瘤竞争力。 < em J World J Microbiol Biotechnol。 12（2）：157-162。
Triplett，E.W。和Sadowsky，M.J。（1992）。豆科植物结瘤竞争遗传学。 Annual Reviews in Microbiology 46（1）：399-422。
Vincent，J.M。（1970）。根瘤菌的实际研究手册根瘤细菌的实际研究手册。
Weir，B.S。（2012）。根瘤菌目前的分类法 NZ Rhizobia网站。