材料和试剂

具有不同固有抗生素抗性的两种中华根瘤菌（EM）中华根瘤菌（菌株A和B）（例如菌株A是新霉素敏感和菌株 B是在某种浓度的新霉素抗新霉素）注意：或者，可以通过使用gfp和rfp，抗血清或其他标记基因来区分菌株（Triplett和Sadowsky，1992）。
Medic属truncatula 种子
次氯酸钠
氯化钠（Macron Chemical，目录号：7581-06）
浓硫酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：A300-212）
乙醇（Decon Labs，目录号：2701）
抗生素
阳光混合物＃5：比例为1：1的Turface混合物（SunGro Horticulture）
Turface MVP（简介产品有限责任公司）
胰蛋白胨（BD，目录号：211699）
酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，目录号：DF0127071）
（赛默飞世尔科技公司，目录号：C79-3）。
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
KNO 3（Thermo Fisher Scientific，目录号：P263-500）
（Acros，目录号：423535000）。
（光谱，目录号：C1145）和/或
MgSO 4·7H 2 O（J.T.Baker ，目录号：2504）
Fe-EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6760-5000）
MnCl 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：M33-500）
（Mallinckrodt，目录号：2549）
O（J.T.Baker ，目录号：4382）
NaMoO 4（Sigma-Aldrich，目录号：S6646）
（Thermo Fisher Scientific，目录号：C-493）
（EMD Millipore，目录号：PX1595-1）
（Sigma-Aldrich，目录号：C3771）
石蜡（Thermo Fisher Scientific，目录号：P-21硬）
TY介质（参见配方）
N 2无营养素溶液（参见配方）
无菌石蜡包被砂（见配方）

设备

用于Leonard罐组件的MAGENTA容器GA-7（Sigma-Aldrich，目录号：V8505）和棉绳（直径为1/4英寸）
滤纸P5（Thermo Fisher Scientific，目录号：09-801C）
植物生长室（TC2，环境生长室作为实例，但可以使用其他植物生长室）
高压灭菌器

程序

苜蓿种子灭菌
1. 放置种子在15毫升塑料猎鹰管。加入3ml硫酸将种子暴露5-8分钟，在通风橱中偶尔混合个人保护设备。
2. 用移液管快速除去酸，用无菌双蒸水洗涤4次
3. 将种子浸泡在10％次氯酸钠中90秒。
4. 用无菌水冲洗8次
5. 将种子放在培养皿中的无菌滤纸上，用2ml无菌水润湿
6. 将种子在冰箱中在4℃（在黑暗中）3-5天。
7. 将种子移至室温（在黑暗中），让其静置1天以预发芽
中华根瘤菌菌株
1. 将中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）菌株在TY培养基中振荡生长2天。
2. 将培养物以8,000×g离心10分钟，并用无菌的0.85％氯化钠洗涤两次。
3. 将所得培养物用无菌0.85％氯化钠稀释至10 7细胞/ml
4. 使用稀释的10 7个细胞/ml培养物制备接种物混合物。两种菌株的比例可以在1：1,000至1,000：1之间变化
共接种和植物生长条件
1. 准备含有Sunshine混合物的无菌Leonard罐组件混合物＃5和Turface MVP以1:1的比例混合。无氮植物营养溶液用于浇水。
2. 在1cm深孔中种植三个发芽的种子，并在每个Leonard瓶中用土壤轻轻地覆盖种子。
3. 使用移液管接种1毫升接种混合物的每个种子，其中两种菌株的比例从1:1,000至1,000:1变化。我们建议使用5种不同比例接种混合物，未接种对照和用单一菌株接种的对照植物。
4. 将瓶在25℃的植物生长室中孵育16小时光照条件和21℃在黑暗中8小时。湿度应该在50-70％之间。光照条件应为200-350μmol/m/s
5. 一周后，用灭菌的石蜡包被的砂覆盖土壤通过用无菌镊子切割除去额外的植物。每罐只包含1株植物。
恢复和鉴定结节中的中华根瘤菌菌株
1. 培养28天后，从中随机收集10-15个结节每个植物根部，并置于1.5ml离心管中通过切片根结节每侧约0.5厘米
2. 表面的结节通过浸入95％乙醇中10秒然后消毒在2％（v/v）次氯酸钠溶液中5分钟
3. 的结节用无菌水冲洗5次，并转移至含有100μl无菌0.85％NaCl的96孔微量滴定板。
4. 使用无菌牙签将每个孔中的表面消毒的结节压碎
5. 将悬浮液在TY板上划线
6. 将来自每个TY板的三个单菌落转移到TY 板含有在每种菌株的特定浓度的抗生素耐。
7. 结节中的菌株由抗生素抗性决定。
竞争性结瘤的定量评价
1. 结节的竞争能力由结节占据量化率在七个接种混合物，与两个菌株的命题范围为1：1,000至1,000：1。
2. 结节占位率 A通过除含有菌株A的结节数来计算（N A A + N B）的总结节（N A A）。
3. 一种菌株两种菌株统计学上更大的结节占据率以1:1的比例（通过显微计数确定）共接种比其他菌株更高的结瘤竞争能力。
4. 竞争力由线性定量评估结节数之比的对数之间的关系由两个菌株（N A A/N B B）中的每一个形成的比率的对数和两个菌株的细胞数目（I A A/I B）：对数（N A A/N B B） logC AB + k·log （I /I ）（Amarger和Lobreau，1982）。
5. 截距回归线，C AB值是表示菌株A的相对于菌株B的竞争性.C AB 接近1，当两个菌株具有同等的竞争性结瘤。如果C sub AB大于1，则染色A具有更高的结瘤竞争性关于菌株B.作为例子，结瘤竞争之间。药物 WSM419野生型及其同基因nolR 突变体在Sugawara和Sadowsky的论文（2014）中提出。

代表数据

图1. 恢复和鉴定中华根瘤菌宿主豆结核中的菌株的实验方案 Medicago truncatula

食谱

TY介质
5克胰蛋白酶
3g酵母提取物
1.3g CaCl 2·6H 2 O·6H 2 O或0.87g CaCl 2·2H 2 O.H 2 O ₂ O
用蒸馏的H 2 O将其调至1L，并通过高压灭菌
灭菌对于板，加入1.5％琼脂

N无营养物溶液（Bucciarelli等人，2006）

KNO ₃	15 mM
Ca（NO 3）2 sub 2 4H 2 O	12.5 mM
Ca（H 2 PO 4）sub 2 2/2	1 mM
MgSO 4。。 O	1 mM
Fe-EDTA	0.01 mM
MnCl 2	0.004 mM
H ₃ BO ₃	0.02 mM
ZnSO 4 。 7H O	0.0004 mM
NaMoO ₄	0.0001 mM
CuSO 4 ^。 5H sub 2 O	0.0001 mM
K ₂ SO ₄	12.5 mM
CaSO 4 ^。 2H O	9 mM

沙
1. 将1g石蜡溶解在100ml氯仿中（在通风橱中混合，需要时间溶解）。
2. 将溶解的石蜡倒在金属盘中的2kg白色细砂上。
3. 将石蜡/氯仿用砂彻底混合，并在罩内蒸发氯仿过夜。
4. 将石蜡包被的砂子分配到高压灭菌容器中并高压灭菌1小时。

致谢

本研究得到国家科学基金资助1237993。

参考文献

Amarger，N。和Lobreau，J.P。（1982）。根瘤菌属菌株的结瘤竞争力的定量研究。 em> Appl Environ Microbiol 44（3）：583-588。
Bucciarelli，B.，Hanan，J.，Palmquist，D.and Vance，C.P。（2006）。分析Medic藜表皮发育的标准方法。 Plant Physiol 142（1）：207-219。
Sugawara，M。和Sadowsky，M.J。（2014）。通过norR突变体增强中华根瘤菌药物的结瘤和结节发育， > Medicago 宿主基因型。 Mol Plant Microbe Interact 27（4）：328-335。
Toro，A。（1996）。根瘤菌 - 共生共生中的结瘤竞争力。 < em J World J Microbiol Biotechnol。 12（2）：157-162。
Triplett，E.W。和Sadowsky，M.J。（1992）。豆科植物结瘤竞争遗传学。 Annu Rev Microbiol 46：399-428。
Weir，B.S。（2012）。根瘤菌目前的分类法。新西兰根瘤菌网站。