材料和试剂

实验室小鼠，C57BL/6株，2-4个月龄
注意：所有协议均已获得Sanford-Burnham医学研究所动物护理和使用委员会批准。
异氟烷（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-363629Rx）
Ham's F-10培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11550-043）
马血清（Life Technologies，Gibco ，目录号：16050-122）
II型胶原酶（Life Technologies，Gibco ，目录号：17101-015）
Dispase II（Roche Diagnostics，目录号：04942078001）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（Life Technologies，目录号：10010-023）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
山羊血清（Life Technologies，Gibco ，目录号：16210-072）
抗体
1. 生物素CD45（克隆30-F11,0.5mg/ml）（BD Biosciences，目录号：553078）
2. 生物素CD31（克隆390,0.5mg/ml）（eBioscience，目录号：13-0311-85）
3. 生物素CD11b（克隆M1/70,0.5mg/ml）（BD Biosciences，目录号：553309）
4. 生物素Ly-6A/E-Sca1（克隆E13-161.7,0.5mg/ml）（BD Biosciences，目录号：553334）
5. 7-整联蛋白/PE或FITC（克隆R2F2,1mg/ml）（AbLabs，目录号：53-0010-01）
6. CD34/Alexa Fluor 647（克隆RAM34,0.2mg/ml）（BD Biosciences，目录号：560230）
7. 链霉亲和素APC-Cy7（0.2mg/ml）（BD Biosciences，目录号：554063）
8. 链霉亲和素微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-048-101）
9. FxCycle紫染色剂（DAPI，0.5mg/ml）（Life Technologies，Invitrogen ，目录号：F10347）
媒体（见配方）
股票胶原酶II型溶液（见配方）
消化培养基I（参见食谱）
消化培养基II（参见食谱）
FACS缓冲液（见配方）

设备

异氟烷蒸发器，供应气体（氧气），流量计和感应室
TC处理的培养皿（10cm）（Corning Incorporated，目录号：430167）
无菌（50ml）聚丙烯离心管（BD Biosciences，目录号：352098）
无菌（15ml）聚丙烯离心管（BD Biosciences，目录号：352096）
LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
细胞过滤器（70μm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：22363548）
使用20G×1"针（BD Biosciences，目录号：309644）的注射器
将5ml FACS圆底管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352063）
用于肌肉解剖和绞碎的工具：剃刀刀片和/或小剪刀，镊子
组织培养层流罩
摇水浴
标准温度控制台式离心机
MACS磁选机和多支架（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302和130-042-303）
流式细胞仪[，（装备有488,405和633nm激光的FACSAria细胞分选仪）（BD Biosciences）
注意：可以调整颜色组合以符合可用的激光组合。

软件

FlowJo软件（Tree Star，可选）

程序

温热介质在37℃水浴中。
在外科手术台上，收获后肢肌肉; 将来自一个后肢的所有肌肉置于具有4ml预热的培养基（每次一只小鼠，将分离的肌肉保持在37℃）的10cm培养皿中（视频1）。
1. 通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并通过颈椎脱臼处死
2. 去除覆盖后肢肌肉的皮肤。
3. 切断跟腱，分离腓肠肌和比目鱼肌。
4. 切断前房肌肉的远端肌腱，包括胫骨前伸肌和伸肌伸肌，使用剃刀刀片从胫骨分离
5. 分割四头肌腱，使用剃刀刀片将股四头肌与股骨分离。
视频1.后肢肌肉隔离
剁碎肌肉从一个后肢在10厘米的菜，用介质使用2个剃刀刀片成小块（1-2板一次，保持所有其他样品在37℃）。
一旦所有肌肉被切碎，使用镊子将肌肉片从每个盘转移到15毫升离心管。物件应该粘在一起并且容易地作为一个或两个聚集体拾取并放入管中（图1和图2）。
1. 使用5毫升吸管，从菜和任何肌肉收集媒体不用镊子拿起的片断，并将其添加到15毫升离心管
2. 用5 ml培养基洗板，加入 15 ml离心管。每个管现在包含9ml培养基和肌肉件。
3. 加入1ml原胶原酶溶液，以达到10ml的消化培养基I的最终体积。
图1.肌肉转移

图2.停止
将样品放在摇动的水浴上，温热至37℃，在175-325rpm下90分钟。或者，如果摇动水浴不可用，将样品放在37℃培养箱中，通过每15-20分钟倒转管手动混合内容物。然而，这可能由于次优消化而降低产量。
在室温下以300×g离心样品5分钟
吸出上清液并重悬于10ml消化培养基II中
短暂涡流样品，并返回到37℃摇动水浴，在200rpm下30分钟
向上/向下移动以破碎肌肉块，并使每个样品通过具有20G针的10ml注射器10次，以进一步释放所有单核细胞成悬浮液。一旦完成，就不会有可见的肌肉块。
将样品转移到50ml离心管中，用12ml培养基洗涤每个15ml离心管2次
在4℃下以300×g离心样品5分钟
吸出上清液，将样品重悬于10ml培养基中，并通过新鲜50ml离心管顶部的70μm细胞滤器; 用12 ml培养基洗涤原管2次
在4℃下以300×g离心样品5分钟
吸出上清液，重悬样品在600μl培养基，并转移到15ml离心管，然后用400μl培养基洗涤原管。在这一步骤中，可以将来自两条腿的样品合并成一个管，使得分选样品包含来自一只小鼠的所有肌肉的细胞在2ml培养基中。
加入10微升细胞悬浮液从2毫升分选样品在500微升培养基和以下体积的抗体分开的5毫米FACS管单色控制：
1. 无抗体（未染色对照）
2. 1μlFxCycle紫色染料（DAPI）
3. 1μlα7-整合素/PE或FITC
4. 4μlCD34/Alexa Fluor 647
5. 1μl生物素CD45
将以下体积的一抗添加到原始2ml分选样品中：
1. 5μl生物素CD45
2. 10μl生物素CD11b
3. 10μl生物素CD31
4. 10μl生物素Ly-6A/E-Sca1
轻轻涡旋样品，在冰上孵育20分钟
加入10ml冷冻培养基以分选样品或3ml FACS缓冲液至单色对照
在4℃下以300×g离心样品5分钟
吸出上清液，重悬样品在1.5毫升培养基或单色控件在500微升FACS缓冲液
加入1微升链霉亲和素APC-Cy7到生物素CD45单一颜色控件，并在冰上孵育20分钟。
添加以下二级抗体以分选样品（首先是微珠，然后是剩余的抗体）：
1. 150μl链霉亲和素微珠
2. 10μlα7-整合素/PE或FITC
3. 30μlCD34/Alexa Fluor 647
4. 10μl链霉亲和素APC-Cy7
轻轻涡旋样品，在冰上孵育20分钟
加入10ml冷冻培养基以将样品分选或3ml FACS缓冲液加入生物素CD45单色对照
在4℃下以300×g离心样品5分钟
预装LS柱（每个样品一个），用3ml培养基消耗
吸出上清液，将样品重悬在1ml培养基中，或将生物素CD45单色对照在500μlFACS缓冲液中重悬。
将每个样品装载到放置在MACS磁性分离器上的LS柱上，用3-4ml培养基（尽可能多地将样品保持在冰上）清洗原离心管2次。
在4℃下以300×g离心样品5分钟
吸出上清液，重悬样品在2毫升FACS缓冲液转移到5毫升FACS管，并添加2微升FxCycle紫染料（DAPI）到每个样品。
保持在冰上，直到准备好在BD Biosciences FACSAria细胞分选仪上分选（图3）一个。电池应通过100μm喷嘴在20 psi下分类

图3.基于FACS的卫星细胞分离。代表性的FACS图和门控方案，用于纯化对CD45，CD31，CD11b和Sca1阴性并表达α7-整联蛋白和CD34的单核卫星细胞（左图）。代表FACS图，其显示在重排的卫星细胞中的α7-整联蛋白和CD34表达

笔记

在肌肉解剖和绞碎步骤期间，寻找并丢弃没有有效消化的大块厚白色腱，并且可能在步骤9堵塞注射器和针。
在酶消化之前基于剃刀的切碎是方案中的关键步骤;切成大块将导致组织不完全消化，而切成小块将降低产量
可以收集来自步骤7的上清液，进一步用冷PBS稀释，在400×g离心8分钟并保持在冰上，直到在步骤12过滤之前回到主样品，以潜在地增加产量。 br />
组织消化后的细胞悬液应保存在冰上或4℃，以减缓卫星细胞活化，并在样品制备后尽可能快地分选，特别是如果在假定静止时对新鲜分离的细胞进行分析。
在观察到增加的自发荧光之前，可以使用300-900μg/ml的FxCycle紫色染料（DAPI）。或者，碘化丙啶可用于区分活细胞和死细胞，但是用这种配色方案更难以进行荧光补偿。
通过FACS分析，来自一个成年小鼠，C57BL/6株，2-4个月龄的细胞产量应当为约150,000-200,000个事件，并且在手动计数时为75,000-100,000个卫星细胞。

食谱

媒体
Ham's F-10培养基和10％马血清
0.2μm无菌过滤并在4℃下保存
股票胶原酶II型溶液
称量和溶解胶原酶粉末在介质（配方1）中，原料浓度为7,000单位/ml
单位每毫克根据批次不同，计算需要相应调整
可以将股胶原酶溶液等分并在-20℃保存长达6个月或在4℃保存1天。
不要冻结/解冻多次
消化培养基我
9ml培养基（配方1）和1ml原胶原酶II型溶液（配方2）
消化培养基II
9.86ml介质（配方1）
143μl原液胶原酶II型溶液（配方2，100单位/ml终浓度）
20单位分散II（粉末形式，在使用前称重）
FACS缓冲区
486.5 ml 1x PBS
12.5ml山羊血清（2.5％终浓度）和1ml 0.5M EDTA（1mM终浓度） 0.2μm无菌过滤并在4℃下保存

致谢

这个协议是从Tom Rando和Helen Blau的研究小组发布的以前的工作改编和修改的。该工作由肌营养不良症协会MDA Grant 200845，Ellison Medical Foundation新学者奖AG-NS-0843-11和美国国立卫生研究院（NIH）授予R01AR064873，R03 AR063328，P30 AR061303至AS和美国国立研究所健康（NIH）授予F31 AR065923-01至MT。

参考文献

Liu，L.，Cheung，T. H.，Charville，G. W.，Hurgo，B. M.，Leavitt，T.，Shih，J.，Brunet，A.and Rando，T.A。染色质修饰作为肌肉干细胞静止和时间衰老的决定因素细胞Rep 4（1）：189-204。
Sacco，A.，Doyonnas，R.，Kraft，P.，Vitorovic，S。和Blau，H.M。（2008）。单一移植肌肉干细胞的自我更新和扩增 /em> 456（7221）：502-506。
Tierney，M.T.，Aydogdu，T.，Sala，D.，Malecova，B.，Gatto，S.，Puri，P.L.，Latella，L.and Sacco，A。（2014）。 STAT3信号控制卫星细胞扩增和骨骼肌修复。 Nat Med 20（10）：1182-1186。