Prepare dilutions from the 10 mM NH₄⁺ stock in a 0.05 mM - 1 mM range and use ultrapure water as blank. For example: blank; 0.05 mM; 0.1 mM; 0.2 mM; 0.4 mM; 0.6 mM; 0.8 mM; 1 mM.

Material harvest and homogenization
1. In a 96 deepwell (1.2 ml) plate, place 2 glass beads (4 mm diameter) into each well.
2. Weight approximately 20 mg of fresh leaves or roots and place them in a microplate deepwell half-submerged in liquid nitrogen. Store at -80 °C until use.
3. Grind frozen tissue with a TissueLyser two times for 60 sec at 27 Hz frequency. The plates are coupled to the TissueLyser with the TissueLyser Adapter Set 2 x 96. (Ensure sealing of the wells during homogenization).
Extraction
1. Add 500 μl ultrapure water per well.
2. Grind again as in step B3 (make sure the water is not frozen before grinding).
3. 在80℃的干燥箱中孵育样品10分钟（孵育也可以在水浴中进行）。
4. 在板式离心机中以4,000rpm和4℃离心板20分钟
5. 回收在新的96深孔板中的上清液（400μl），并保持在冰上的样品。
铵含量测量
1. 放置50μl的提取物（或50μl的标准品的校准曲线），在96孔分光光度计微孔板中。
2. 向每个样品中加入100μl溶液A，50μl溶液B和最后100μl溶液C.
3. 使用50微升水代替植物提取物，使空白
4. 在室温下孵育30分钟。
5. 在分光光度计（图1）中读取635 nm处的吸光度。
6. 建议每个样品或标准进行三次技术重复。
图1.代表性铵标准曲线当铵含量高于每分钟1微升反应混合物的1nmol NH 4+时，吸收开始饱和。线性回归是在达到饱和之前执行

数据分析

从每个样品的吸光度减去空白吸光度，并用标准品校准曲线计算铵浓度。最后，以鲜重表示铵含量。这些计算也可以通过微孔板读数器软件直接进行，分配给每个孔一个类别，例如空白，标准或样品。

笔记

这个协议可以很容易地适应于Eppendorf管和分光光度计比色皿代替96孔板只是缩放卷。类似地，样品的均质化可以用研钵和杵替代TissueLyser。
如果可能，我们建议做每一个96孔板步骤使用多移液器以节省时间，从而获得重现性样品。

食谱

解决方案A
0.33M苯酚钠
准备2 M NaOH溶解8 g NaOH在100 ml超纯水中
用超纯水将2.8g苯酚钠与4ml 2M NaOH混合，最终体积为50ml 确保溶液的pH值约为13
解决方案B
0.02％硝普钠
将20mg硝普钠溶于100ml水中
在使用
前准备
解决方案C
2％次氯酸钠
将1ml商业漂白剂稀释在49ml超纯水中
10mM NH 4 ⁺储液（对于标准曲线）
将33.025mg的（NH 4）2 SO 4溶解在50ml超纯水（当然NH 4）中， Cl也可以作为标准）

致谢

该协议根据Solorzano（1969）报道的方法从Sarasketa等人（2014）修改。这项工作得到了欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）的巴斯克政府（IT526-10），UPV/EHU（EHUA14/14），人民计划（Marie Curie Actions）编号334019和MINECO（BIO2014-56271-R）。

参考文献

Sarasketa，A.，Gonzalez-Moro，M.B.，Gonzalez-Murua，C.and Marino，D。（2014）。在大面板的拟南芥自然种质中探索铵耐受性。/a> J Exp Bot 65（20）：6023-6033

Solorzano L.（1969）。通过酚 - 次氯酸盐方法测定天然水中的铵。 Limnol Oceanogr 14：799-801 />