材料和试剂

小鼠：女性年龄和体重匹配的共生标记的MMTV-PyMT小鼠[具体应变信息参见Franklin等人（2014）]
注射麻醉（氯胺酮/赛拉嗪混合物：150mg/kg/15mg/kg）
防腐液（Betadine）
70％乙醇
眼用软膏（Paralube）
镇痛药（丁丙诺啡，0.1mg/kg）
无润湿无菌水（HydroGel）
无菌盐水溶液（0.9％NaCl）
1x PBS
10x PBS
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
胶原酶III型（Worthington Biochemicals，目录号：LS004182）
Percoll（Sigma-Aldrich，目录号：P1644）
HBSS +氯化钙+氯化镁（Life Technologies，目录号：14025）
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
CD45.1 APC-eFluor 780（eBioscience，目录号：47-0453-82）
CD45.2 PerCP-Cyanine5.5（eBioscience，目录号：45-0454-82）
MHC II类（I-A/I-E）FITC（eBioscience，目录号：11-5321-82）
CD11b Pacific Blue TM（Life Technologies，InvitrogenTM，目录号：RM2828）
Ly-6C APC（BD Pharmingen，目录号：560595）
Ly-6G PE（BD Pharmingen，目录号：551461）
Fc嵌段（2.4G2），（BD Pharmingen，目录号：553142）
RPMI 1640（Life Technologies，目录号：11875-093）
消化缓冲液（参见配方）
100％Percoll（见配方）
44％Percoll（见配方）
66％Percoll（见配方）
FACS缓冲区（参见配方）

设备

不可吸收的黑色尼龙缝合线（4-0,13mm，3/8圈）（Ethicon，目录号：1854G）
伤口夹钳（伤口钳）（伤口钳（Autoclip，9mm）（Braintree Scientific，目录号：ACS KIT）
棉针头（3英寸，木杆）（Fisherbrand，目录号：23-400-105）
无菌纱布（Fisherbrand，目录号：22-028-558）
带锁定机构的针夹（Fine Science Tools）
剪刀（精细工具）
弯曲镊子（2对）（Fine Science Tools）
剃刀片
幻灯片（Corning Incorporated，目录号：2948-75X25）
加热灯
加热垫
电动剃须刀
手术巾/无菌垫（Fisherbrand）
6孔非组织培养处理的平板（Falcon ）
70微米细胞过滤器（Falcon ，目录号：352350）
50ml锥形管（Falcon ）
15ml锥形管（Falcon ）
3ml注射器（BD Bioscience）
U-底96孔板（Falcon ）
台式离心机（Sorvall）
37°C水浴
流式细胞仪（BD LSR II或类似）

程序

Parabiosis
这种外科手术将导致在连接部位处形成微血管，从而在癌基因诱导的乳腺肿瘤的发生过程中在两只动物之间共享血液循环。
1. 通过高压灭菌或浸泡在70％乙醇中至少30分钟灭菌所有手术工具。
2. 将所有无菌工具和必要材料布置在干净的手术帘/无菌垫上
3. 用加热灯加热清洁的笼子，以便在恢复期间使用。
4. 使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（IP）麻醉小鼠。动物们应该完全镇静（通过对趾压缩没有反应来测量）然后继续。在整个麻醉，应用眼膏软膏眼睛。
5. 小鼠麻醉后，刮胡子一个配偶体的侧翼和另一个配偶体的左侧翼。所有小鼠应在手术期间保持在加热垫上
6. 启动过程开第一个合作伙伴。将鼠标放在其侧面的无菌纱布和消毒剃须区域以准备切口，交替消毒溶液和70％乙醇3次，使用新鲜棉头涂抹器。在皮肤上做一个小切口大腿，距离膝关节约0.5厘米。插入尖端将剪刀插入切口并打开和关闭鼻子剪刀将皮肤拉离覆盖腿部的内筋膜肌肉。这将允许你暴露肌肉和髌腱的后肢在后续步骤中缝合
7. 切直线从这个切口到肩部刚好通过肘关节。重复打开和关闭剪刀的整个长度切口，小心地保持身体壁完整
8. 保持您的拇指和食指之间的后肢的踝关节，小心翼翼地从皮肤上操纵膝盖，使髌骨成为暴露和向上转，面向你。插入针不可吸收的缝合在胫骨和腓骨之间从里面腿向外，约在膝下方1/3处。避免刺穿主要血管。拉动缝合线直到2-3英寸的自由端保留（该自由端将用于连接到另一端合作伙伴，所以确保有足够的长度，你舒适地执行两次仪器领带平结）。绑扎缝线用针架，用仪器领结方形结（两针的结是足够的）。将有两端的缝合线辐射从结，2-3英寸自由端和端部连接针。尽可能靠近结，切开针头，离开自由端可用于结合后续步骤。尝试保护在大腿外侧的结，这将使连接两个合作伙伴更容易。关于如何进行手术结合的详细说明可以在 http：//www.bumc.bu。教育/外科/培训/技术培训/仪器领带/
9. 在前肢上重复此过程，使用剩余长度来自步骤A8的缝合线（针端）。插入缝合针半径和尺骨，在肘部的正下方，从内到外
10. 保持第一伴侣在加热垫上，躺在它的一边切口朝上，在第二个匹配的切口伙伴。重复与第1个伙伴相同的步骤。你现在有 4宽松的缝合线，所有的结都朝上。
11. 至连接两个老鼠，把他们两个在他们的背上，与他们的腹部面向上，并且它们的切口彼此面对。插入缝线针下髌骨腱的第一伙伴从里面膝盖到外面，然后在第二的髌骨腱下伙伴从外部到内部（一个连续运动）。绑定缝合（两次），并切割两个松散的末端，靠近结可能使缝合线末端的刺激最小化。小心不要意外地将步骤A8的缝合线结扎到结中
12. 至连接后肢缝线，翻转老鼠，使他们躺在他们胃。使用针托执行2次仪器在来自步骤A8的缝合线端部上打结方形结，并切割松散端。保持小鼠在他们的胃，使用持针器绑一起来自步骤A9的前肢缝合（2次的仪器领结方形结）和切开松散端。
13. 这些缝线后绑在一起，小鼠将处于其最终连接位置注意排列前肢和后肢的方式，将使步行尽可能容易。两个伙伴现在应该紧紧并且与它们的体壁稳定地保持在一起，与其接触其他。
14. 使用9 mm伤口夹闭合皮肤切口。这个程序最好由两个人进行，一个人握住皮肤一起施加伤口夹子。使用两个弯曲端镊子，握住皮肤襟翼从两侧的小鼠向上和远离他们的身体墙壁。在这一步，滚动非常重要皮肤的外边缘彼此分开以避免夹紧任何剩余的毛发进入伤口。这也防止皮肤卷曲入伤口。应用第一个伤口夹在里面皮肤襟翼彼此接触，距离边缘大约0.25cm 切口，从尾端开始朝向头部工作，将每个伤口夹子紧挨着前一个夹子。通过拉皮肤，同时剪裁，你防止剪辑到身体的墙壁或连接鼠标太紧密在一起。一次在背部的剪报侧的伤口是完整的，翻转小鼠到他们的背部和应用夹子到伤口的腹侧，在皮肤保持在一起如前所述。可能需要应用额外的剪辑靠近前肢和后肢，以完全闭合伤口
15. 后剪辑完成，将小鼠放在他们的胃，在无菌纱布上，在温暖的笼子里。加热灯必须使用，直到老鼠完全清醒和行走
16. 注射每个合作伙伴与500微升无菌盐水（sub-Q），手术后立即每天2次手术后4-7天。
17. 手术后立即注射每个合作伙伴止痛剂（IP），术后1-2天每天1次。
18. 在笼子底部提供无润湿的无菌水1 周手术后，提供持续的润湿食物实验
19. 如果维持小鼠超过1个月，使用伤口夹子去除剂在3-4周去除伤口夹。
肿瘤隔离和治疗
1. 乳房肿瘤变得可触摸后，安乐死小鼠和删除肿瘤从每个伙伴的未连接的一侧。不要隔离乳腺/肿瘤。必须特别小心以避免破坏淋巴结以防止用淋巴结白细胞污染肿瘤制备物。这是特别是对于发现旁边的乳腺非常重要腹股沟淋巴结。通常最好避免去除这种肿瘤完全。此外，一些乳腺不会触摸肿瘤，然而由于大小，该对小鼠将必须实施安乐死的一种或多种肿瘤。在这种情况下，所有肿瘤和乳腺可以（仅在一只个体小鼠中的池肿瘤），或分析
2. 取出肿瘤，并置于1×PBS中的6孔板在冰上
3. 通过用剃刀刀片切割成小块来处理肿瘤并在10-15ml消化缓冲液中孵育肿瘤（参见Recipes），在37℃水浴中1小时。涡流管每15-20 min。
4. 消化后，将肿瘤和消化缓冲液倒在70℃ 微米细胞滤器过滤到6孔板中。通过细胞的Mash肿瘤过滤器与来自3ml注射器的柱塞的背部。洗涤过滤器用1×PBS并将细胞过滤器移动到下一个孔。继续糖化，洗涤，并将细胞过滤器移动到板的下一个孔直到大多数肿瘤组织已经解离
5. 转让消化并过滤的肿瘤组织至50ml锥形管血清移液管，用1x PBS洗涤所有孔以收集任何剩余的细胞，并在台式离心机中以650×g离心6分钟（总共体积将为40-50ml）
6. 倒出上清液并将细胞沉淀重悬于10ml 44％Percoll中，并转移至15ml锥形管中。
7. 在管底部缓慢下层，用3ml 66％Percoll 使用5ml血清移液管，拔出吸管作为Percoll 沉积，注意不要扰乱44％和66％Percoll。
8. 1500分钟旋转，30分钟，4℃，无制动/最低制动设置。
9. 除去管顶部的碎片，以及3-5 ml 44％Percoll。收集细胞在界面"血沉棕黄层"使用p1000微量移液管和转移到干净的15ml锥形管中。大方的体积在此步骤收集（总共4-5ml），同时避免红细胞在管的底部沉淀。在650分钟x 下旋转5分钟。
10. 用10ml 1x PBS洗涤，以650×g离心5分钟。
免疫浸润的FACS分析
1. 将免疫细胞沉淀重悬于足够体积的1×PBS中转移到96孔板用于FACS染色，约100 μl/孔，并置于冰上
2. 在FACS中制备抗体混合物缓冲液，50μl/孔。下面列出的抗体适用于鉴定骨髓细胞，包括巨噬细胞，单核细胞和中性粒细胞 CD45.1 APC-eFluor780,1:400
  CD45.2 PerCP-Cyanine5.5,1:300
  MHC II类（I-A/I-E）FITC，1：1,200
  CD11b Pacific Blue，1：800
  Ly-6C APC，1:500
  Ly-6G PE，1:500
  Fc嵌段（2.4G2），1:400
3. 在桌上型离心机中以500×g离心3分钟通过轻拂板丢弃上清液。重悬每个细胞沉淀 50μl抗体鸡尾酒。孵育板，覆盖，在冰上30分钟。
4. 在150μl的1×PBS中洗涤2x，并重悬于1×PBS中用于使用流式细胞仪进行分析。

代表数据

图1.血源性前体在发展PyMT肿瘤中有助于巨噬细胞群体。代表性的数据预期来自于仿生实验。将两个重量匹配的8周龄，同系标记的雌性PyMT小鼠手术连接并维持约3个月。从每个配偶体的未连接侧移除乳腺组织/肿瘤并合并（将组织/肿瘤合并在每只小鼠内，但不在小鼠之间）。如上所述处理肿瘤。门控群体定义如下：CD45 +，MHCII +，CD11b，sup，乳腺组织巨噬细胞（MTM），CD45 +肿瘤相关巨噬细胞（TAM），CD45 +和MHCII抗体，CD11b肿瘤相关巨噬细胞（TAM），CD45 - 肿瘤相关巨噬细胞> hi Ly6C ⁺，中性粒细胞和CD45 ⁺ MHCII ^{-CD11b ^{单核细胞。单核细胞。单核细胞。}}

笔记

这个协议是使用MMTV-PyMT肿瘤模型开发的，但是它可能被用于研究其他模型。不管使用的模型，所有小鼠必须进行先天标记以区分源自个体伴侣的细胞。此外，如果可能，应避免使用雄性小鼠，因为外科手术后可能发生战斗
如果使用MMTV-PyMT模型，动物必须尽早（6-8周）连接，以便在肿瘤变得可触知之前进行手术。从实践的角度来看，这是重要的，因为在乳腺附近进行手术和实验观点，因为很难解释在肿瘤发展的后期阶段连接的小鼠的数据。
CD45.1/CD45.2嵌合体在乳腺组织/肿瘤中的相对百分比取决于每只小鼠在手术（6-8周是最佳的）和处死后的肿瘤阶段。不变地，一个伙伴将具有比另一个更成熟的肿瘤，并且这将反映在嵌合度，获得的浸润细胞的数量和乳腺组织巨噬细胞（MTM）：肿瘤相关巨噬细胞（TAM）比率上。例如，在上面所示的代表性数据中，CD45.1 ⁺伴侣具有更晚期的肿瘤，因此具有较低程度的嵌合现象，包含更多的浸润细胞，并且具有较低的MTM：TAM比率TAM，而不是MTM，是主导巨噬细胞群体[参见Franklin等人（2014）了解更多信息]。
在对单个活细胞门控后观察到的CD45.1 ^- CD45.2 ^-群体（参见代表性数据）表示肿瘤细胞，并且在晚期或坏死肿瘤中更加突出。

食谱

消化缓冲区
1x HBSS
胶原酶III（〜280U/ml） DNase I（4μg/ml）
100％Percoll
45 ml Percoll
5ml 10×PBS
44％Percoll
22ml"100％"Percoll
28 ml 1x PBS
66％Percoll
33ml"100％"Percoll
17ml RPMI（提供颜色，使界面更清晰）
FACS缓冲区
1x PBS
1％BSA
0.02％叠氮化钠

致谢

我们感谢刘刘的她的教学的抛物线技术。这项工作是由癌症研究所肿瘤免疫学前基金奖学金培训补助金（R.A.F），癌症研究所诊所和实验室集成计划授予（M.O.L.）和美国癌症协会研究学者奖（M.O.L.）支持。

参考文献

Franklin，R.A.，Liao，W.，Sarkar，A.，Kim，M.V.，Bivona，M.R.，Liu，K.，Pamer，E.G.and Li，M.O。肿瘤相关巨噬细胞的细胞和分子起源 em> 344（6186）：921-925。