材料和试剂

植物组织
60％（vol/vol）高氯酸（HClO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：244252）
硝酸（HNO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：225711）
18兆欧（MΩ）-cm去离子水（去离子水）
NaCl标准，参见两种制备Na标准的方法的配方
ICP-OES校准标准品（Agilent，目录号：6610030700）
Kimwipe条，W×H：30×5mm（通过切割单层Kimwipe手工制备）（Kimtech Science Kimwipers，目录号：34120）
NaCl标准（见配方）
从1M NaCl标准品制备Na标准品的替代方法（参见配方）
植物生长培养基的组成（见配方）

设备

Perkin-Elmer Optima 2000DV电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）或类似机器
通风橱
加热玻璃试管的加热块
具有平端的一次性硼硅酸盐玻璃管（O.D.xL：16×125mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-961-30）
将具有网格（L×W×H：100mm×100×15mm，三十六个13×13mm正方形的网格）（Thermo Fisher Scientific，目录号：08-757-11A）的无菌方形陪替氏培养皿

程序

该实验设计为遵循根尖吸收Na，然后将其转运到幼苗的地上部分（Choi等人，2014）。

在表面上生长拟南芥野生型Columbia_0（WT Col_0）植物生长培养基[包括0.5％（w/v）Phytagel]在100×100mm 在长日照条件下（16小时光照/8小时）平皿培养10天黑暗）。
覆盖根尖（〜5毫米的根尖）1小时用50μlDI润湿的单层Kimwipe条（W×H：30×5mm）水（图1A）。
在这个适应期后，浸泡 Kimwipe条用50μl去离子水再洗10分钟（对照）或50μl100mM NaCl（10分钟盐胁迫）。
中这些控制和盐处理，培养皿应提高〜15 mm，将它们放在第二个空培养皿中。这第二个培养皿应该放在培养皿的末端最远从幼苗根中最接近子叶/芽端植物（图1B）。此协议确保水或NaCl应用到Kimwipe条不能被动地沿着表面流动植物朝向芽。

图1.盐胁迫实验在方形培养皿中进行。 A. 100×100mm培养皿的顶视图与10，10 d old拟南芥（seedyl）。根尖覆盖与单层Kimwipe条（W×H：30×5mm）。 B.侧视图培养皿与凸起的射击结束，以防止被动液体流动射击组织。培养皿覆盖有盖子以保持湿度高培养皿内。
在去离子水中快速冲洗待分析的组织，以去除被动粘附在其表面的任何Na
收获〜50毫克的新鲜组织，并记录每个的重量样品。例如，从根或枝条获得〜50mg的样品您将需要至少10株8-10天的拟南芥植物每个样品。你还需要计划至少三个独立实验三个技术重复每个实验为鲁棒统计分析
在通风橱中，消化每个样品单独的玻璃试管（用1％（vol/vol）硝酸洗涤并干燥在组织消化之前）在0.6ml硝酸中在120-150℃下培养〜2小时或直到所有植物组织完全溶解。 120℃ 使用加热块容易维持温度
添加进一步0.4ml的60％（vol/vol）HClO 4，并在150-180℃下孵育另外2小时或直到总样品体积减少至≤0.5ml。无需不断摇晃或混合样品。
冷却至室温，加入去离子水至5ml。
现在可以使用Perkin-Elmer测定钠浓度 Optima 2000DV电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）或类似设备说明。例如，Perkin-Elmer Optima的参数设置 2000DV为0.60L/min雾化器流速，1ml/min样品流速和 4个总样品用量为4次重复（每次重复1ml）
Na水平的原始结果可以转换为百万分之几（毫克/升）使用标准曲线（图2）。做到这一点标准曲线，Na标准浓度值（mg/L）绘制为x轴值和对应的校正/归一化的Na 强度值（表2）作为y轴值。这些数据然后可以使用转化为每千克鲜重的毫克（1）：
Na标准的数据是如表1-2和图2所示。该实验的典型数据为如表3-6和图3所示：
1. 表1，从Na标准品获得的原始Na强度值。
2. 表2，Na标准品的校正/归一化Na强度值使用获得的表1中的原始Na标准强度值。表2"注"中描述了校正/归一化的方法
3. 图2，校正/归一化Na强度值的标准曲线
4. 表3，对照和10分钟盐处理的拟南芥样品的Na强度值的原始数据。
5. 表4，从表3获得的校正/归一化Na强度值
6. 表5，对照和10分钟盐的Na含量（ppm）（mg/L）处理的拟南芥幼苗。 Na强度值转换为ppm （mg/L）使用基于线性获得的等式2进行校正Na标准物的回归分析（图2）。
7. 表6，使用方程式1（上述步骤11）将表5中的Na水平的最终转化为"mg/kg鲜重（F.W.）"。
8. 图3，Na含量以mg/kg F.W.在根中的比较10 响应于100mM盐处理的拟南芥幼苗。

代表数据

表1. ICP-OES 检测到的Na标准的原始强度值表。

Na浓度（μM）	强度值
Na浓度（μM）	复制＃1	复制＃2	复制＃3	复制＃4	平均
0（去离子水）	-13101	-12852	-13607	-13906	-13367
1	62192	62167	62641	62635	62409
10	207932	206271	203571	207676	206363
100	8783775	8703642	8666576	8517874	8667967
200	20306803	20237705	20096115	20508961	20287396
500	63460855	63572884	64524580	64081778	63910024

表2.原始Na标准值
的校正*强度值表

Na浓度（μM）	校正强度值
Na浓度（μM）	复制＃1	复制＃2	复制＃3	复制＃4	平均
0（去离子水）	265	515	-241	-539	0
1	75559	75533	76007	76001	303101
10	221299	219637	216938	221043	878916
100	8797141	8717009	8679942	8531241	34725332
200	20320170	20251071	20109481	20522327	81203049
500	63474222	63586251	64537946	64095145	255693563

注意： ^* Na强度通过减去来自原始Na强度的去离子水中的原始Na强度值值。例如，在上述数据集中， DI水中的平均Na信号强度值=（（-13101）+（-12852）+ （-13607）+（-13906））/4 = -13367。校正/归一化强度值重复＃1的去离子水然后是-13101 - （-13367）= 265。

的方程式从图1中的代表性Na标准曲线获得是Y = 5.545×e + 006×-1.706e + 006 其中Y是校正的Na信号强度，X是Na水平，mg/L。因此，Na水平以mg/L为单位从未知样品可以使用公式2计算

图2.校正的Na信号强度的Na标准曲线。 Na 标准图使用GraphPad Prism（Ver.6）软件产生（ www.graphpad.com ）。实线表示校正的Na强度（y 轴）至相应的Na浓度（ppm）（mg/L，x轴）。虚线线表示校正/归一化Na的线性回归分析标准（R sup 2，0.9912;斜率，5.545e + 006 ±111579;当X = 0时的Y截距， -1.706e <+ sup> +006 ±573942; P 值， 0.0001）。

表3.来自对照和10分钟盐胁迫的拟南芥苗的Na信号强度值的原始数据

	信号强度
	复制＃1	复制＃2	复制＃3	复制＃4	平均
控制根＃1	14268939.3		14259302.6		14393306.5
控制根＃2		18113970.6	18776953.2		18366989.3
控制根＃3	15961897.1	15946196.2	16018475.1	16181451.1	16027004.9
10分钟盐胁迫根＃1		16462936.7		16373113.5	16436543.5
10分钟盐胁迫根＃2	16710847.8	16254854.6	16242386.2	16349709.2
10分钟盐胁迫根＃3	16776297.9		17026112.0	17105345.0	16851115.3

注意：使用ICP-OES的Na检测重复4次（4次技术重复）从三个独立的生物复制品（根＃1-＃3）每次治疗（共12次重复）。

表4.来自表3的原始数据的校正/归一化Na信号强度值

	校正/规范信号强度
	复制＃1	复制＃2	复制＃3	复制＃4	平均
控制根＃1	14282305.8	14529236.6	14272669.1	14542480.6	14406673.0
控制根＃2	18403612.3	18127337.1		18600154.1
控制根＃3	15975263.6	15959562.7	16031841.6	16194817.6	16040371.4
10分钟盐胁迫根＃1	16537643.2	16476303.2	16799213.6	16386480.0	16449910.0
10分钟盐胁迫根＃2	16724214.3	16268221.1	16255752.7	16363075.7	16402816.0
10分钟盐胁迫根＃3	16689664.4	16610072.6	17039478.5	174118711.5	16864481.8

表5. Na信号强度值与ppm（mg/L）浓度的转换
0.019
...

	Na水平（mg/L）
	复制＃1	复制＃2	复制＃3	复制＃4	平均	标准偏差（SD）
控制根＃1	2.883	2.928	2.882	2.930	2.91	0.027
控制根＃2	3.627	3.577	3.624	3.662	3.62	0.035
控制根＃3	3.189	3.186	3.199	3.228	3.20	0.019
10分钟盐胁迫根＃1	3.290	3.279	3.265	3.263
10分钟盐胁迫根＃1	3.290	3.279	3.265	3.263	3.259	3.27	0.040
10 min salt stress root #3	3.318	3.303	3.381	3.395	3.35	0.045

Note: Na intensity from the samples can be converted into ppm (mg/L) using the equation 2.

Table 6. Conversion of Na level to ‘mg/kg fresh weight (F.W.)

	Na level (mg/kg F.W.)
	replicate #1	replicate #2	复制＃3	复制＃4	平均	标准偏差（SD）
控制根＃1	2151.8	2185.0	2150.5	2186.8	2168.51	20.096
控制根＃2	2706.4	2669.3	2704.6	2732.9	2703.30	26.116
控制根＃3	2379.6	2377.5	2387.2	2409.2	2388.38	14.473
10分钟盐胁迫根＃1	2611.2	2602.4	2591.4	2589.6	2598.64	10.116
10分钟盐胁迫根＃2	2518.0	2455.7	2454.0	2468.7	2474.08	29.997
10分钟盐胁迫根＃3	2047.9	2039.0	2086.8	2095.6 /	2067.31	28.055

注意：使用公式1将表5中的以ppm（mg/L）表示的Na水平换算为"mg/L鲜重"中的Na水平。

图3.在响应盐胁迫时10d旧的拟南芥根中Na水平（mg/kg FW）的比较。将10天的拟南芥幼苗的根尖进行盐应力与100mM NaCl 10分钟，如上所述。错误栏， n = 12的标准偏差（P <0.001）。 ***学生t检验p值 < 0.001与对照相比。

笔记

一些水源含有高水平的Na，其将为每个样品提供背景。重要的是，根据制造商的说明，使用ICP-OES校准标准对ICP机器进行校准。来自Agilent Technologies的ICP-OES的一种商业校准混合物在5％（v/v）HNO 3中含有500mg/L Ca，Fe，K，Mg和Na。一旦机器校准，测量Na校准曲线（参见配方），特别注意0 Na点，以确定是否发生显着的Na污染。使用去离子水是必要的，但如果设备以前用于具有高Na含量的样品，也可能发生污染。在这种情况下，需要用去离子水彻底冲洗设备
本方案中提供的示例性数据集是从22天在长日光循环（16小时光照/8小时黑暗）下生长的10日龄拟南芥野生型Columbia-0生态型幼苗获得的。因此，Na积累值可能根据植物物种，生长条件，年龄和基因型而变化。

食谱

NaCl标准

Na（μM）
NaCl（g/L）

0
0

1
0.000023

10
0.00023

100
0.0023

200
0.0046

500
0.0115

注意：按照指示将NaCl溶解在去离子水中。

从1M NaCl标准品制备Na标准品的另一种方法

准备1毫升的1M Na标准溶液通过溶解0.023克 NaCl溶于1ml去离子水中并涡旋，直到NaCl完全溶解

稀释1 M NaCl标准溶液，如下所示

NaCl标准	NaCl标准体积	去离子水的体积	稀释系数	总体积（ml）
10 mM	10μl的1M NaCl	990微升	1：100	1 ml
1 mM	1ml 10mM NaCl	9 ml	1:10	10 ml
500μM	5ml 1mM NaCl	5 ml	1：1	10 ml
200μM	2ml 1mM NaCl	8 ml	1：5	10 ml
100μM	1ml 1mM NaCl	9 ml	1:10	10 ml
10μM	0.1ml 1mM NaCl	9.9毫升	1：100	10 ml
1μM	0.1ml100μMNaCl	9.9毫升	1：100	10 ml

注意：确保最少5毫升NaCl标准溶液作为一个测量使用1ml的每种标准溶液，但对每种标准溶液进行复制点。

植物生长培养基的组成
植物生长培养基是由3mM KNO 3，2mM Ca（NO 3）2 Sub 2+组成的半强度Epstein培养基。/NH 4 H 2 O，0.5mM MgSO 4 .7H 2 O 2，1mM（NH _{微量营养物是25μMKCl，17.5μMH 3 BO 3 Sub，1μMMnSO 4 sub。 H 2μM，1μMZnSO 4 sub，7H 2 O 2，0.25μMCuSO 4 sub/（NH 4）6 MoO 24子午线，0.25μM（NH 4）6 MoO 24子午线， 4H 2 O和25μM（乙烯 - 二次氮基）四乙酸（Fe-Na EDTA）。}

致谢

作者衷心感谢国家航空航天局（NNX13AM50G）和国家科学基金会（NSF IOS-11213800，MCB-1329723）的资助，支持这项工作。该方案改编自Lahner等人（2003），对于使用新鲜组织的小样本尺寸略微修改。

参考文献

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Deinlein，U.，Stephan，A.B.，Horie，T.，Luo，W.，Xu，G.and Schroeder，J.I。（2014）。植物耐盐机制趋势植物科学 19 （6）：371-379。
Kader，M.A。和Lindberg，S。（2005）。在盐的盐敏感和耐盐性栽培品种的原生质体中摄取钠，Oryza由荧光染料SBFI确定的 L. 56（422）：3149-3158。
Lahner，B。，Gong，J.，Mahmoudian，M.，Smith，EL，Abid，KB，Rogers，EE，Guerinot，ML，Harper，JF，Ward，JM，McIntyre，L.，Schroeder， DE（2003）。拟南芥中营养和微量元素的基因组规模分析。 a> Nat Biotechnol 21（10）：1215-1221
Shabala，L.，Cuin，T.A.，Newman，I.A。和Shabala，S。（2005）。拟南芥切根的盐诱导离子通量模式 > sos 突变体。 Planta 222（6）：1041-1050。