材料和试剂

细胞（例如 RAW264.7，Raji，小鼠天然B细胞）
台盼蓝染色（0.4％溶液）（Life Technologies，目录号：15250-061）
CD43微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-049-801）
Blocking One（Nacalai tesque，目录号：03953-95）
抗小鼠LAMP1（eBioscience，目录号：1D4B）
抗GM130（BD biosciences，目录号：35/GM130）
抗Rab5（Santa Cruz Biotechnologies，目录号：D-11）
抗钙联蛋白（Enzo Life Sciences，目录号：ADI-SPA-860）
抗COX IV（Cell Signaling Technology，目录号：4844）
抗大鼠Ig（H + L）-HRP（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：712-036-153）
抗小鼠Ig（H + L）-HRP（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：115-035-062）
抗兔Ig（H + L）-HRP（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：111-035-144）
ECL底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：34095）
蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：87785）
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail（Thermo Fisher Scientific，目录号：78420）
60％OptiPrep（Axis-Shield plc，目录号：1114542）
解决方案A（参见配方）
解决方案B（参见配方）
解决方案C（参见配方）
解决方案D（参见配方）
解决方案E（参见配方）
30％，23％，17％，11％和5％Optiprep（各2ml）（参见配方）
TBS-T（参见配方）

设备

10厘米培养皿
离心管（Beckman Coulter，目录号：347357）
血细胞计数器
离心机（推荐使用冷却功能）
1 ml注射器，带29号针头

程序

当分析常规细胞系（例如 RAW264.7，Raji或HEK293T）或体积中具有大细胞溶质的细胞时应选择方案A，而应选择方案B用于小细胞或具有小细胞质，例如淋巴细胞。

从10cm皿（每个样品2个皿）中提取细胞的程序
1. 层360μl的每种梯度溶液（30％，23％，17％，11％ 5％OptiPrep）在离心管中用P200微量移液管，如图所示在图1中
  
  图1.显示使用P200微量移液器分层梯度溶液的方法的示意图。使用P200微量移液管（180μl×2次）将360μl每种梯度溶液小心倒入离心管中，不要产生气泡，也不要打扰其他层。在离心管中从最重（30％）到最轻（5％）溶液的层
2. 将管在4°C下放置1小时以上，并保持静止直至使用。
3. 确认细胞（例如 RAW264.7或Raji）是健康的，在显微镜下75-80％融合。
4. （任选）用兴奋剂处理所需的时间（例如100ng/ml的LPS，持续30分钟）。
5. 用10ml冰冷的PBS洗涤两次，转移到合适的管，并用血细胞计数器和锥虫确定细胞密度和存活力蓝色染色
6. 将1.5〜2.0×10 7个细胞转移到新管中，并在4℃下以1,100rpm离心5分钟。
7. 吸出上清液，轻拍管以松开细胞，并每管加入450μl冰冷的溶液E.
8. 通过80号通过80-100通道匀浆细胞直到细胞显示大约70-80％的台盼蓝阳性。应保存细胞冷。
9. 在4℃下以1,000xg离心匀浆5分钟并将整个上清液（核后级分）转移至新的 1.5ml管，并在1,000℃下在4℃下再次离心5分钟。重复这一步直到细胞碎片沉淀后才能看到离心（通常3次）注意：全部上清应该取第二次离心，第三次离心离心。离心后上清液的初始体积应该是大约400μl，并且在2次离心之后将是减少到约。 350微升。
10. 小心地将300μl上清液层叠在步骤A1（图3）中制备的梯度溶液的顶部
11. 将离心管置于冷冻超速离心机转盘TLS-55中。
12. 通过Optima MAX-TL在4℃下以39,000rpm（130,000xg）离心4小时。
  注意：将加速度（Accel）和减速度（Decel）分别设置为8和0（自由减速度）。
13. 收获185微升每一部分，使用P200微量移液器制成11个部分，并转移到1.5毫升微管。
14. 储存于-80℃直至使用。
小鼠原初B细胞的操作
1. 层360μl的每种梯度溶液（30％，23％，17％，11％ 5％OptiPrep）在离心管中用P200微量移液管
2. 将管在4°C下放置1小时以上，并保持静止直至使用。
  通过使用CD43-微珠和MACS分离天然脾细胞根据制造商的说明（请参见以下链接： http://www.miltenyibiotec.co .jp /〜/media/Images/Products/Import/0001200/IM0001263.ashx ）。
3. （任选）用刺激剂处理1.5〜2.0×10 8个B细胞达期望的期间（例如，CpG-1668在100nM下1小时）。
4. 用10ml冰冷PBS在合适的管中洗涤两次，和用血细胞计数器和锥虫确定细胞密度和活力蓝色染色
5. 将细胞转移到新管中，并在4℃下以1,100rpm离心5分钟
6. 吸出上清液，轻拍管以松开细胞，并每管加入450μl冰冷的溶液E.
7. 通过大约200次通过29规格均匀化细胞直到细胞显示70-80％的台盼蓝阳性。细胞应该是在冰上保持冷。
8. 将匀浆在1,000×g离心5分钟 min，并在4℃下转移上清液（后核组分）新的1.5 ml管。重复此步骤三次。
9. 小心地将300μl上清液层放在梯度顶部
10. 将管置于冷冻超速离心机转子TLS-55中。
11. 通过Optima MAX-TL在4℃以39,000rpm（130,000xg）离心4小时。
  注意：将加速度（Accel）和减速度（Decel）分别设置为8和0（自由减速度）。
12. 使用P200微量吸管收集每个级分290μl以制备7个级分，并转移至1.5ml微量管。
13. 储存于-80℃直至使用。
分馏的评价
1. 取30μl的组分，并与等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液混合。
2. 在95℃短暂变性后，应用15μl样品进行SDS-PAGE并转移到PVDF膜。
3. 用封闭块封闭印迹，然后与孵育针对细胞器标记物的一抗。使用以下抗体在这个协议; 抗LAMP1（稀释1：1,000）用于检测晚期内体/溶酶体，抗GM130为顺式高尔基体，抗Rab5为内体，ER的抗钙联蛋白和线粒体的抗COX IV，分别
4. 用TBS-T洗涤印迹3次以除去过量的抗体（5分钟×3次）
5. 与与HRP偶联的正确二级抗体孵育 1小时[抗大鼠Ig（H + L）用于抗LAMP1，抗小鼠Ig（H + L）用于抗GM130或抗-Rab5，抗兔Ig（H + L）用于抗钙联蛋白或COX IV。第二抗体的浓度大致为50 ng/ml]
6. 用TBS-T洗涤印迹以除去过量的抗体（15分钟×3次）
7. 与ECL底物孵育，并检测发光信号（图2）。
  
  图2.将小鼠幼稚B细胞的细胞内囊泡分级分离，并通过用针对以下细胞器标记物的特异性抗体的western印迹分析其分布;具有LAMP1的晚期内体/溶酶体，具有GM130的顺式高尔基体，具有Rab5的泛内含体，具有Calnexin的ER和具有COXIV的线粒体。。

笔记

对于细胞的均质化，可以使用Dounce匀浆器或其它装置，因为匀浆化困难程度取决于细胞类型。
对于诸如小鼠幼稚B细胞的小细胞，根据细胞密度，用29G注射器传代的次数可能不同。

食谱

解决方案A
60％OptiPrep

解决方案B
OptiPrep稀释剂

（组件）	100 ml	（最终浓度）
H sub 2 O	〜42.8 ml
1 M Hepes（pH7.5）	15 ml	150mM
1 M KCl	23.5毫升	235 mM
1 M MgCl 2	1.2 ml	12 mM
1 M CaCl 2	2.5 ml	25 mM
0.2 M EGTA	15 ml	30 mM

用1M KOH调节至pH7.0，并加至100ml

解决方案C
40％OptiPrep工作溶液
2 vol。的溶液A + 1vol。的解决方案B

解决方案D
工作溶液稀释剂
（组分）100ml（最终浓度）

（组件）	100 ml	（最终浓度）
H sub 2 O	〜81 ml
1 M Hepes（pH7.5）	5 ml	50 mM
1 M KCl	7.8 ml	78 mM
1 M MgCl 2	400μl	4 mM
1 M CaCl 2	840微升	8.4 mM
0.2 M EGTA	5 ml	10 mM

用1M KOH调节至pH7.0，并加至100ml

解决方案E
均质介质

（组件）	100 ml	（最终浓度）
H sub 2 O	〜81 ml
1 M Hepes（pH7.5）	5 ml	50 mM
1 M KCl	7.8 ml	78 mM
1 M MgCl 2	400μl	4 mM
1 M CaCl 2	840微升	8.4 mM
0.2 M EGTA	5 ml	10 mM
蔗糖（FW 342.30）	8.56克	250 mM

用1M KOH调节至pH7.0，并加至100ml 使用前添加Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒和Halt磷酸酶抑制剂鸡尾酒

30％，23％，17％，11％和5％Optiprep（各2ml）

（组件）	30％	23％	17％	11％	5％
溶液C（40％Optiprep）	1500微升	1150微升	850微升	550μl	250微升
解决方案D	500微升	850微升	1150微升	1450微升	1750微升
停止蛋白酶抑制剂*	20微升	20微升	20微升	20微升	20微升
停止磷酸酶抑制剂†	20微升	20微升	20微升	20微升	20微升

*停止蛋白酶抑制剂鸡尾酒
†Halt磷酸酶抑制剂混合物

图3.超速离心之前完成的Opti-prep梯度图。

TBS-T

（组件）
1 L
（最终浓度）

1M Tris-HCl（pH7.5）
20ml
20 mM

NaCl
8克
137 mM

吐温20
1 ml
0.1％

致谢

我们感谢K. Furuyama-Tanaka和S. Shimabukuro-Demoto的技术援助。该协议改编自Axis-shield的密度梯度方案S44。这项工作得到了下一代世界领先研究人员资助计划（下一个计划; NT-S。，LS134），日本教育，科学，体育和文化部的科学研究资助对于NT-S，21390123，对于TK，25871165），以及来自国家全球健康和医学中心（用于NT-S，23S001）的赠款。

参考文献

Kobayashi，T.，Shimabukuro-Demoto，S.，Yoshida-Sugitani，R.，Furuyama-Tanaka，K.，Karyu，H.，Sugiura，Y.，Shimizu，Y.，Hosaka，T.，Goto，，Kato，N.，Okamura，T.，Suematsu，M.，Yokoyama，S.and Toyama-Sorimachi，N。（2014）。组氨酸转运蛋白SLC15A4可协调mTOR依赖性炎症反应和致病性抗体产生。免疫 41（3）：375-388。