材料和试剂

本尼特烟草种子
农杆菌菌株GV3101（从University of UCBekeley's Plant and Microbial Biology department的Markus Pauly博士的实验室获得）
PRO-MIX HP MYCORRHIZAE™土壤混合物（Promix，目录号：20381RG）
Miracle-Gro ^®水溶性多用途植物食品（Scotts）
pART27表达载体（Gleave，1992）
胰蛋白胨（MP Biomedicals，目录号：1010817）
酵母提取物（U.S.Biotech Sources，目录号：Y01PD-500）
NaCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：S271-3）
4'-羟基-3'，5'-二甲氧基苯乙酮（乙酰丁香酮）（150mM，在DMSO中）（Sigma-Aldrich，目录号：D134406-1G）
铝箔（Reynolds包装76.2m×304mm）（Reynolds Consumer Products Inc.）
液氮
100x Halt TM蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：78429）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
Bradford试剂（Bio-Rad Protein Assay Dye reagent Concentrate）（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ，目录号：500-0006）
用于Ni-NTA珠粒洗涤和洗脱的小柱（任何适合1.5ml Eppendorf管，例如小量制备柱）的柱子
500μlVivaspin Column MWCO 5000（Sartorius stedim biotech，目录号：VS0111）
Ni-NTA珠（QIAGEN，目录号：1018240）
用于Bradford测定的96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：80040LE0910）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：M33-500）
磷酸二氢钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S369-500）
磷酸氢二钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S374-500）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I-2399）
Lennox LB媒体（见配方）
渗透缓冲液（参见配方）
磷酸钠缓冲液（见配方）
提取缓冲液（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

设备

植物盆（400ml体积或类似物，Gage Durapot）（Merrill's Packaging，目录号：03GA-0350S）
植物生长盘（T.O.Plastics，目录号：710245C）
不会接触叶的高盖（Acrodome）（Drader Manufactoring Industries Ltd.，目录号：69973）
砂浆和杵
500 ml培养瓶
浸渍容器的浸渍容器。本生植物（例如 250ml烧杯）
金属珠（2.38mm）（工具供应，目录号：6230）
球磨机（混合机Mill 400）（RETSCH，目录号：MM 400）
能够在长日照条件（16小时光照/8小时黑暗）下持续26℃的植物生长室，所述条件具有170-190μmolm -1 s -1的光强度。
用水冲洗瓶子。
孵育器/轨道摇床，能够在30℃下以230rpm孵育500ml培养物
能够测量OD <600>的分光光度计
大型离心机能够在5,000×g /分钟下旋转250ml或更大体积，持续10分钟
干燥器或真空室
真空泵（Savant Systems LLC，目录号：Gel Pump-GP110）
-80°C冰箱
旋转搅拌器/圆形振动器
台式离心机（500-20,800×g，4℃）
分光光度计能够在595nm处进行96孔板测量

程序

植物生长条件
N的制备。本生烟草植物是获得令人满意的蛋白质表达的关键步骤; 植物应该尽可能有力地帮助其在浸润后的恢复和随后的蛋白质生产。在该协议〜6周龄。 benthamian 植物用于土壤根瘤农杆菌渗入。
1. 在长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗）在26℃下生长植物，具有170-190μmolm -1 -2光子强度和70％的最佳湿度。< br />
2. 在水浸泡的土壤混合物（Promix HP mycorrhizae; 400ml盆; 视频1）并生长2周，然后移植到最终目的地锅（400ml）
  
  <播种种子（0秒），移植苗（50秒）和进行真空渗入（1分45秒）的程序的详细描述
3. 移植幼苗仔细保留尽可能多的根可能（视频1）。移植后用奇迹施肥一次根据制造商生长多用途植物食品（Scotts）推荐和水。这些花盆应该种植另外4周，直到他们准备好转型。在此期间第一周生长幼苗被保持覆盖。多在这个阶段受精轮次可能导致过度增长产生对于渗透而言太大的植物。它也可以增加在托盘之间的重叠会产生问题操纵材料。从第五周开始特别重要的是监测植物发育以便计划渗透程序。理想情况下植物将完全膨胀4-5 叶直径7厘米，5-6周浸润（视频1）
4. 当准备好渗透时，如果可能，运输植物几个小时提前到工作现场，用大量的水喷洒叶子，保持植物覆盖以防止叶枯萎。
构建体，土壤杆菌培养物和真空浸润在该方案中描述的感兴趣的蛋白质在其C末端用6个组氨酸标记。将该构建体克隆到在35S启动子控制下的pART27二元载体中（Gleave，1992）。将载体转化到土壤杆菌菌株GV3101中用于N。本氏体瞬时转化。
1. 农杆菌准备
  1. 土壤杆菌培养物兴趣，空载体和P19）应从新鲜的殖民地开始或在补充有合适的抗生素的LB培养基中的甘油储备液并在30℃和230rpm下培养。至少200毫升的体积应该使用并培养直至达到1-2（〜48小时）的OD 600
  2. 什么时候培养物呈现增加的浊度，测量OD 600并计算使得对于每种构建体在浸润缓冲液中将获得至少250ml OD 600的最终体积0.7 0.7。如果必要允许培养物生长更长以达到所需量细胞。当与P19，一种基因沉默抑制基因共浸润（Voinnet等人，2003），每个个体的最终计算的OD 600 构建体应当至少为0.7（总OD 600将是两者的总和个体OD）。理想地，构建体之间的最终OD <600>比率利息和P19应为0.7：1
  3. 在22℃和5,000xg下旋转电池10分钟。
  4. 通过倾析弃去LB培养基上清液，尽可能多地除去上清液
  5. 使用浸润缓冲液重悬细胞沉淀
  6. 加入500微升乙酰丁香酮（4'-羟基-3'，5'-二甲氧基苯乙酮; 150mM在DMSO中） ml的浸润缓冲液中的悬浮细胞
  7. 在室温下孵育细菌3-4小时，然后浸润。
2. 真空渗透程序（有关此部分的详情，请参阅视频1）
  1. 覆盖 N的顶部。本氏烟壶带铝箔。这是为了防止过程中的过多土壤损失和保持渗透缓冲液尽可能干净，用于多次渗透。一个方片的箔，大于花盆，从一个切开侧面到中心，使一个易于使用的一次性封面
  2. 地点具有在烧杯或容器中的细胞的浸润缓冲液允许完全浸没 N。 benthamiana 在浸泡时离开。
  3. 将植物地上部分浸入细胞悬浮液，确保所有的叶浸没在浸润缓冲液中。小心不要打破叶柄或损坏植物
  4. 与植物在真空中放置烧杯室或干燥器能够承受真空压力。根据对容器的大小可用，多个工厂可以同时渗透
  5. 使用足够强的真空泵产生真空，其将大部分气体从叶中抽出（at 至少90kPa）。当施加真空时，可观察到气泡出叶。对于每次渗透施加真空3分钟，轻轻释放真空，重复操作共三次次。
  6. 从浸润缓冲液中除去植物。树叶成功渗透应该有半透明或水浸的外观。删除任何不成功的树叶渗透。没有完全淹没的叶子通常不会渗透非常好。
  7. 将植物放在有盖的托盘中，底部有大量的水。将植物返回生长室。
  8. 根据植物恢复的情况，在浸润后24-48小时从托盘上取下盖子
蛋白质提取和部分纯化
这里描述的部分蛋白质纯化基于6x组氨酸C-末端标签对含镍树脂的亲和力。亲和力基于上述两个基团的电荷。在植物中，这种方法已被证明是有用的;然而，仅使用这种技术难以获得目标蛋白质的纯制剂。本文所述的方法能够富集目标蛋白质，但不产生完全纯的级分。为此，应该平行进行"空载体"蛋白质提取，以确保使用部分纯化的蛋白质的每个下游实验具有适当的阴性对照。
1. 蛋白质提取
  1. 在3-5天收获。本生植物叶通过在液氮中快速冷冻蛋白质来提取蛋白质。根据被表达的蛋白质，更短的孵育期可以尝试渗透。
  2. 预研磨叶（空载体对照和用P19共转化的感兴趣的构建体）砂浆和杵与液氮。这种粉末可以储存在-80℃ C。预研磨可以促进蛋白质的进一步加工提取
  3. 向2ml管中加入3个金属珠（2.38mm）
  4. 不允许预地叶解冻（在干冰上工作，冷室，如果可用），将〜1ml的研磨材料放入2ml 管。如果需要，可以按比例按比例放大此卷。
  5. 使用珠磨机（Retsch球磨机）在25Hz下在液氮中冷冻2.5分钟来研磨材料。
  6. 向1 ml提取缓冲液中加入10μl100x Halt™蛋白酶抑制剂混合物（0.99x）和0.14μlβ-巯基乙醇（1.98mM）（终浓度为49.5mM磷酸钠，0.99M NaCl和9.9mM） mM咪唑）
  7. 在4℃下温和搅拌孵育1小时。使用旋转搅拌器或允许缓冲液移动的类似装置在试管中并完全混合样品
  8. 一小时后，用磁铁除去金属珠，始终将样品保持在冰上
  9. 通过在4℃和20,800×g离心10分钟来沉淀植物碎片
  10. 收集约1.1毫升上清液到新的2毫升管中
  11. 再次在4℃和20,800×g离心10分钟，以沉淀任何残留叶碎片。
  12. 收集1毫升的上清液，并转移到一个新的管。根据被处理的体积，它可以是2ml管或更大。始终将样品保存在冰上。
  13. 测量蛋白质含量使用Bradford测定法（Bio-Rad Protein Assay Dye 试剂浓缩物）。建议使用96孔板格式与牛血清白蛋白标准曲线。蛋白质测量对于标准化蛋白质负载量是重要的亲和珠，应预期2-3mg总蛋白/ml。在这可以检测阶段蛋白质粗提物的存在使用免疫印迹技术（西方或点印迹）。这是建立在蛋白质的条件设置表达。
2. 镍NTA珠制备
  1. 重新暂停Ni-NTA 珠并收集100μl到1.5ml管（50μl树脂，树脂通常构成产品体积的一半）。
  2. 在500×g下旋转1分钟，除去上清液
  3. 用500μl提取缓冲液洗涤3次，使用相同的离心条件。最终悬浮进行 500μl提取缓冲液
  4. 洗涤后，向每1ml粗蛋白上清液中加入10μl树脂（110μl悬浮液）。
3. 部分蛋白质纯化
  1. 在4℃下温和搅拌孵育1小时以允许标记蛋白质结合到Ni-NTA珠。在此期间不需要蛋白质的沉淀可能发生，在这种情况下是可选择的程序是通过运行将标记的蛋白质结合到树脂上上清液多次通过含有珠子的柱子的所述批处理程序
  2. 旋转以在4℃和500×g下收集珠子1分钟。珠子将在管的底部形成颗粒。
  3. 收集250微升的珠子和上清液，并放入一个小旋转柱用于具有2ml收集管的台式离心机。任何列将适合在类似于Eppendorf的管可以在这里使用，因为它目的只是作为Ni-NTA珠的支撑。柱使用的材料不应该结合蛋白质。这个步骤大大方便了程序，并加快洗涤和洗脱步骤
  4. 在4℃和500×g下旋转1分钟
  5. 用250μl提取缓冲液+蛋白酶洗涤珠子5次抑制剂和β-巯基乙醇（参见步骤C1f）。洗涤包括添加引用卷并丢弃流过离心（4℃和500xg，1分钟）。或者流过的洗涤液可以保持监测蛋白质的存在利用免疫印迹技术
  6. 用200μl洗涤缓冲液
    洗涤4次
  7. 在50μl洗脱缓冲液洗脱6次到新管中
  8. 将洗脱级分（〜300μl）置于500μlVivaspin柱（MWCO 为5,000）用于缓冲液交换。在这种情况下，缓冲液交换由于咪唑与下游测定的不相容性，此过程可能不总是必要的。
  9. 在4°C下旋转和20,800×g 5分钟，并加入300μl50mM甲酸铵（pH值） 4.5）至〜100μl样品（每次稀释4倍）。重复程序共4次，导致回收200μl 含有小于1mM咪唑的材料。蛋白质浓度每1ml植物组织的产量约为0.025mg/ml 原料。

食谱

Lennox LB媒体
溶解于1L水，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和5g NaCl中
渗透缓冲液
10 mM MES
10mM MgCl 2/
pH 5.6
磷酸钠缓冲液（pH 8）
93.2ml 1M磷酸氢二钠 6.8ml 1M磷酸二氢钠加双蒸水至1 L
提取缓冲区
1 M NaCl
50mM磷酸钠（pH8）
10mM咪唑
洗涤缓冲液
300 mM NaCl
50mM磷酸钠（pH8）
20mM咪唑
洗脱缓冲液
300 mM NaCl
50mM磷酸钠（pH8）
150mM咪唑

致谢

该协议是de Souza等人（2014）中描述的扩展。我要感谢Marta L. Bjornson帮助修订稿件，并感谢Katayoon Dehesh博士在修订过程中提供实验室后勤支持。这项工作由加州大学伯克利分校的能源生物科学研究所支持。

参考文献

Choi，W.Y.，Hong，K.J.，Hong，J.E.and Lee，W.J。（2015）。埃博拉疫情的疫苗和药物开发进展 Clin Exp Vaccine Res 4（1）：11-16。
de Souza，A.，Hull，P.A.，Gille，S.and Pauly，M。（2014）。不同植物果胶酯酶PAE8和PAE9及其缺失突变体的鉴定和功能表征。 240（5）：1123-1138。
Gleave，A.P。（1992）。一种具有T-DNA组织结构的多功能双元载体系统，有利于将克隆的DNA有效整合到植物基因组。植物分子生物学 20（6）：1203-1207。
Voinnet，O.，Rivas，S.，Mestre，P。和Baulcombe，D。（2003）。基于番茄丛生特技的p19蛋白对基因沉默的抑制的植物中的增强的瞬时表达系统病毒。植物J 33（5）：949-956。