材料和试剂

3-4周龄野生型或Nup 基因沉默的叶子。本bentiana
注意：
a。该方法可应用于其他具有相对软叶的双子叶植物。
b。对于本塞姆氏烟草的病毒诱导的基因沉默（VIGS）。见张和刘（2014）。
用HPLC纯化的Alexa Fluor-488（购自定制寡核苷酸服务（例如Eurofins Genomics））对10μM48聚体寡聚d（T）进行5'-标记]
注意：溶于TE（Tris-EDTA）缓冲液并储存于-80℃，阴影处。
99.8％甲醇（每个样品4ml）（Wako pure chemical，special glade，目录号：131-01826）
99.5％乙醇（每个样品5ml）（Wako pure chemical，special glade，目录号：057-00456）
99.5％乙醇/二甲苯（1:1v/v，每个样品1ml）（Wako纯化学品，特殊空间，目录号：244-00086）
99.8％甲醇/固定溶液B（1:1v/v，每个样品1ml）
PerfectHyb Plus杂交缓冲液（每个样品2ml）（Sigma-Aldrich，目录号：H7033）
固定鸡尾酒（见配方）
固定解决方案A（参见配方）
固定溶液B（参见配方）

设备

3 ml小瓶容器
旋转振荡器（例如 BioCraft，型号：BC-730）
具有旋转振荡器（例如TAITEC，型号：BR-23FP MR）的杂交炉或培养箱（50℃）
具有用于GFP或Alexa Fluor-488（例如Olympus，型号：FV1000-D）的滤光片的共聚焦激光扫描显微镜（优选）或普通荧光显微镜，

程序

Poly（A）RNA原位杂交
1. 剪切叶子的N. 本哈姆纳成小块（例如 3 mm x 3 mm）刀并放入3ml小瓶容器中〜10片叶/样品。
  请注意，较大的中心不会被AF488探头染污。
2. 在小瓶容器中加入1ml固定溶液A，摇动 80 rpm）在室温（RT）下30分钟。叶片将浮在上面表面的溶液在开始，但会后来下沉（图 1）。
图1. N的叶片。固定溶液A前（左）和后（右）摇动30分钟（步骤A2）之后
1. 通过移液除去固定溶液A.
2. 加入1ml甲醇。在室温下摇动（80rpm）5分钟，除去甲醇（两次）。注意小瓶的内侧应用甲醇充分洗涤
3. 加入1ml乙醇，在室温下摇动（80rpm）5分钟，除去乙醇（三次）
4. 加入1ml乙醇/二甲苯（1:1）。在室温下摇动（80rpm）30分钟删除解决方案。注意叶组织在白色会变白步骤A4-6。
5. 加入1ml 100％乙醇。在室温下摇动（80rpm）5分钟，除去乙醇（两次）
6. 加入1ml 100％甲醇。在室温下摇动（80rpm）5分钟，除去乙醇（两次）
7. 加入甲醇/固定溶液B（1：1）。在室温下摇动（80rpm）5分钟并除去溶液
8. 加入1ml固定溶液A，在室温下摇动（80rpm）30分钟
9. 删除固定解决方案A.
10. 加入1ml固定溶液B.在室温下摇动（80rpm）5分钟，并除去溶液（两次）
11. 加入1ml PerfectHyb Plus，在室温下摇动（80rpm）5分钟
12. 取出溶液，加入1 ml新鲜PerfectHyb Plus。摇（80 rpm）在50℃下在杂交炉（具有旋转振荡器的培养箱中）使用）1小时以上。
13. 加入1μl的10μMAlexa Fluor-488标记的寡聚d（T）。在50℃下摇动（80rpm）过夜。它是优选在紧接着之后进行荧光显微镜样品的制备，但样品可以保持至少a 几天在RT，阴影
显微镜观察
1. 将样品装在PerfectHyb Plus上的带有盖玻片的载玻片上。
2. 用共焦激光扫描观察mRNA的定位显微镜。使用适当的设置检测Alexa Fluor-488 （激发峰490nm，发射峰525nm）。我们一般使用488-nm 激发源，并记录Alexa Fluor-488荧光 500和600nm。
图2.在对照（TRV感染的）或NbNup75 - 沉默的本氏烟草的叶肉细胞中Poly（A）RNA的分布。 em> NbNup75 - 沉默的植物，观察到核中mRNA的异常积累是mRNA输出受损的结果。条=30μm。（Ohtsu 2014）

食谱

固定鸡尾酒（×4）
240mM NaCl 14mM Na 2 HPO 4
6mM NaH 2 PO 4 sub/vbs 5.4 mM KCl
160 mM EGTA
自动保存并在RT保存
固定溶液A（10ml）
固定鸡尾酒（×4）2.5 ml
甲醛250μl
DMSO500μl
Tween20 10μl
庚庚5毫升
h H 2 O 1.74ml
使用前准备
固定溶液B（10ml）
固定鸡尾酒（×4）2.5 ml
DMSO500μl
吐温20 10微升
庚庚5毫升
H O 1.99ml
使用前准备

致谢

该方案改编自Parry等人（2006）和Germain等人（2010）。这项工作得到了日本科学促进会科学研究资助（B）（26292024）的支持。和住友基金会的基础科学研究项目的Grant。

参考文献

本研究结果表明，该方法可以有效地抑制大肠杆菌感染的发生，但是， F.，Zhang，Y。和Li，X。（2010）。 MOS11：mRNA出口途径中的新组件 PLoS Genet 6（12）：e1001250。
Ohtsu，M.，Shibata，Y.，Ojika，M.，Tamura，K.，Hara-Nishimura，I.，Mori，H.，Kawakita，K.and Takemoto， Nucleoporin 75参与乙烯介导的植物抗毒素的生产，以抵抗本尼托克烟到Phytophthora infestans。 Mol Plant Microbe Interact 27（12）：1318-1330。
Parry，G.，Ward，S.，Cernac，A.，Dharmasiri，S。和Estelle，M。（2006）。拟南芥 AUXIN RESISTANCE抑制剂蛋白质是核蛋白质，在其中具有重要作用激素信号传导和发育。植物细胞 18（7）：1590-1603
Zhang，H.and Liu，Y。（2014）。 VIGS测定生物协议 4（5）：e1057。