材料和试剂

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶测定试剂盒（Promega Corporation，目录号：V2460）
蛋白质测定染料试剂（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ，目录号：500-0006）
蛋白磷酸酶（PPase）抑制剂2（I-2）（New England BioLabs，目录号：P0755S）
液氮（N 2）
Tris（pH7.0）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：S312-12）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
Brij 35（Thermo Fisher Scientific，目录：BP345-500）
1x PP2A测定缓冲液（见配方）

设备

用于96孔板（Eppendorf，型号：5810R）的台式离心机
在4℃或冷室中离心（Eppendorf，型号：5415D）
微孔板读数器（xMark TM微孔板吸光度分光光度计）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1681150）
杵和臼
37°C水浴

程序

脱盐柱的准备（注1）
1. 用无菌水预湿试剂盒中提供的旋转柱
2. 从丝氨酸/苏氨酸磷酸酶测定转移10ml G25溶液试剂盒到每个旋转柱，并让G25通过重力沉降5分钟
3. 用10ml无菌水洗涤柱3次，使G25通过重力沉降。不要让G25变干。
4. 用10ml 1×PP2A测定缓冲液洗涤柱3次，使G25 通过重力沉降，用盖子密封柱并继续步骤B1
5. 将柱放入空的50ml离心管中，并在4℃下以600×g旋转5分钟。
细胞提取物的分离和纯化
1. 冻结液体N 2中的植物材料，如果不立即使用，将冷冻样品储存在-80℃冰箱中。
2. 在预冷却的砂浆中将冷冻植物样品在液体N 2中研磨成细粉末，并将转移粉末转移到1.5ml Eppendorf管中。
3. 向每个样品（100 mg粉末）中加入100μl1×PP2A测定缓冲液，涡旋大力解冻样品并在冰上孵育30分钟
4. 在4℃下以13,000rpm离心30分钟
5. 转移上清液到一个新鲜的试管，并短暂孵育粗提取物在冰上。
6. 继续执行步骤A5以准备脱盐柱。
7. 将步骤B5中的上清液转移到步骤A5中制备的脱盐柱
8. 在4℃下以600×g离心样品5分钟
9. 通过流体将流体收集到新管中并保持在冰上
10. 使用Bio-Rad Protein Assay Dye测量蛋白质浓度试剂通过混合200μl染料，800μl水和2μl提取物，然后在室温下孵育5分钟，然后记录OD 595 然后用1x PP2A测定法将蛋白质浓度标准化为1μg/μl 缓冲液（蛋白质浓度= 6.8 * OD595μg/μl）。
构建标准曲线以确定游离磷酸的量
1. 准备含有0,100,200,500,1,000,2,000pmol的试管来自丝氨酸/苏氨酸中提供的10mM标准的磷酸盐磷酸酶测定试剂盒。为了确保数据是可比的，液体中所有试管的最终体积应为50μl
2. 准备钼酸盐染料/添加剂混合物（10μl添加剂到1ml钼酸盐染料中）由套件提供。使用50微升染料/添加剂为每个管和混合涡旋
3. 在室温下以13,000rpm离心30秒
4. 小心地将上清液转移到试剂盒提供的96孔板，同时避免气泡。
5. 离心96孔板2分钟，然后在室温下孵育5分钟
6. 使用600 nm过滤器用读板器读取光密度
7. 基于OD 600读数和测定中使用的pmol磷酸盐制备标准曲线（注5）。
PP2A活性测定
1. 在测定开始前准备钼酸盐染料/添加剂。使用每个PP2A测定50μl染料/添加剂。计算所需的金额实验并且仅为每个测定制备足够的新鲜溶液（注6）。
2. 在冰上混合PP2A测定组分。
  
  组件
  金额
  
  纯化提取物
  5微升
  
  肽底物
  5微升
  
  10x PP2A测定缓冲液
  5微升
  
  PPase抑制剂2
  1微升
  
  无磷水
  34微升
3. 将反应混合物在37℃下孵育5分钟
4. 通过加入50μl染料/添加剂终止反应
5. 充分混合并在室温下以13,000rpm离心1分钟
6. 将混合物转移到96孔板，避免气泡（注7）。
7. 让板在室温下孵育15分钟以进行显色（注8）
8. 使用600 nm过滤器用读板器读取光密度
计算PP2A活性
1. 基于标准曲线，确定从反应中释放的磷酸盐的量
2. 使用以下公式确定PP2A活性 PP2A活性=释放的磷酸盐的量（pmol）/5（min）/5（μg）
3. PP2A活性单位定义为从释放的磷酸pmol 底物每分钟每μg总蛋白。 PP2A活性应为约55-60单位的来自野生型哥伦比亚的细胞提取物拟南芥植物
4. 应进行技术复制和生物复制以获得实验之间的差异。

代表数据

图1.含有设计用于下调AtPTPA的人工微RNA的WT和两种植物（amiR-6和amiR-4）的PP2A活性。对于WT拟南芥的典型测定具有55〜60的PP2A活性单位。由于AtPTPA的mRNA的降解，amiR植物具有降低的PP2A活性，这对于PP2A全酶聚集是必需的（详见Chen等人，2014年）。

笔记

重要的是，蛋白质样品脱盐以除去可干扰由PP2A释放的磷酸盐的测量的游离磷酸盐。
在4℃下离心之前，样品需要完全融化并充分混合
避免转移碎屑，因为它会堵塞脱盐柱。
在离心时使用 x g 力;然而，如果使用微量离心，rpm用于脱盐粗提取物，更高的速度提供不同的脱盐效率和样品产率。
打开套件后，每月建立一个新的标准曲线。有关标准曲线的更多信息，请参阅本套件中的简要手册。链接到手册。
所有测定组分应储存在4℃。切勿冷冻肽底物，试剂盒在打开后应稳定3个月。
如果发生气泡，再次旋转96孔板以除去气泡
如果较高量的蛋白质（大于5μg）用于测定，则允许更多的时间用于显色。确保提取物中PP2A的量不会耗尽肽底物上的磷酸基团。执行滴定实验以确定反应的线性范围，因此实际测定可以在反应的线性范围内进行。

食谱

1x PP2A测定缓冲液
50mM Tris（pH7.0）
0.1mM EDTA
5mM DTT和0.01％Brij 35

致谢

这项工作由生物科学系和德克萨斯理工大学研究生院，中国国家自然科学基金（授予国家沉阳）和浙江省国家自然科学基金资助 .Z12c130011 to Guoxin Shen）。该协议改编自Chen等人（2014）。

参考文献

Chen，J.，Hu，R.，Zhu，Y.，Shen，G.and Zhang，H。（2014）。拟南芥磷酸肌醇磷酸酶激活剂是蛋白磷酸酶2A全酶组装和播放的必需品在激素信号转导，盐胁迫反应和植物发育中的重要作用。植物生理学166（3）：1519-1534。