材料和试剂

用于PCR扩增的寡核苷酸（IDT DNA Technologies）
Taq DNA聚合酶（5,000U/ml）（New England Biolabs，目录号：M0273L）
T7 RNA聚合酶（50000U/ml）（New England Biolabs，目录号：M0251L）
焦碳酸二乙酯（DEPC）（目录号：D5758）处理水
注意：DEPC是一种有毒的烷基化剂，应在化学通风橱中使用适当的个人防护设备（Rupert et al。，2004）。
KCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：P333-500）
MgCl 2·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M9272-1KG）
（Sigma-Aldrich，目录号：223506）。
</sup> 6H 2 O（J.T.Baker，目录号：4036-01）。< br /
（Sigma-Aldrich，目录号：217565）。
UltraPure低熔点琼脂糖（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15517-014）
中和的三（2-羧乙基）膦（TCEP）（Life Technologies，目录号：20490）
精胺四盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：S1141）
聚乙二醇3350单分散（PEG3350）（Hampton Research，目录号：HR2-591）
Tris碱（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-10）
硼酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：A73-1）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP118-500）
尿素（Thermo Fisher Scientific，目录号：U17-12）
RNA结合缓冲液（参见配方）
20 mM精胺溶液（见配方）
结晶溶液（参见配方）
水晶处理解决方案（见配方）

设备

EasyXtal 15孔工具（QIAGEN，目录号：132007）
9孔玻璃凹陷板（Hampton Research，目录号：HR3-134）
MicroSieves和MicroSaws（MiTeGen，目录号：T2-L25-A1）
90°倾斜MicroLoops或MicroMounts（MiTeGen，目录号：M5-L18SP-A2LD或M2-L18SP-A2）
BioRad C1000 Touch PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1851197）
37℃加热块（Eppendorf Thermomixer，目录号：022670107）
尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳系统（CBS Scientific custom）
用于UV遮蔽的手持式UV灯（Spectroline，型号：EF 140C）
Whatman Elutrap RNA电洗脱系统（GE Healthcare Dharmacon，目录号：10447705）
Amicon Ultra离心浓缩器（10kD MWCO，0.5ml）（Millipore，目录号：UFC5010BK）
Leica Stereo显微镜（Leica，型号：M80）

程序

T-box RNA和tRNA的设计和合成用于结晶
1. T盒的初始生物化学和生物物理学表征 RNA-tRNA复合物（Grundy和Henkin，1993）是设计的必要条件和结晶构建体的工程化。 20个甘氨酸特异性的glyQ/glyQS T盒序列选自多重序列对齐，优选嗜热，嗜极和病原生物。甘氨酸特异性T盒系统的选择到期事实上，它是目前唯一的T盒系统展出 tRNA介导的遗传转换与定义的组件。帮助结晶，tRNA ^Gly被循环置换，使得新的5'末端在氨基酸受体臂中的位置5开始，其被a封端稳定，接触友好的GAAA四环（Zhang和Ferre-D'Amare， 2014a; Zhang和Ferre-D'Amare，2013; Zhang和Ferre-D'Amare，2014b）。
2. 使用T7 RNA在体外转录改造的T盒和tRNA 聚合酶，并通过变性尿素PAGE（Milligan和Uhlenbeck， 1989）。我们通常以2-5ml体积进行体外转录并且纯化的RNA的典型产率为0.2-2mg/ml 转录
3. 凝胶带含有所需的RNA 长度通过UV阴影识别，并使用干净的剃刀切除叶片。
4. RNA从其切下的凝胶片电洗脱使用Whatman Elutrap RNA电洗脱系统，在一定体积 500-1,000微升。
5. 使用Amicon洗涤和浓缩洗脱的RNA 超旋转浓缩器（10kD分子量截留，0.5ml）。每离心运行在〜14,000rcf并持续8-12分钟，或直到保留物体积小于100μl。用1 M KCl洗涤RNA一次用DEPC处理的水三次，浓缩并储存在4 °C或-20°C（Klein和Ferre-D'Amare，2006）。
T盒干I-tRNA-YbxF三元复合物的结晶
1. 稀释〜40μl浓缩的tRNA GAAA（约1mM; 24g/L）至〜20μM，使用 1,960μLDEPC处理的水以减少分子间相互作用和二聚。
2. "Snap-cool"tRNA ^GAAA，通过在90℃温育3 然后使用PCR热泳器快速冷却至4℃ 最快的斜率（使用5°C /秒）。或者，之后加热至90℃3分钟，tRNA通过放置快速冷却冰立即。
3. 浓缩物将tRNA重折叠至约12g/L（500μM）使用离心浓缩器（10kD MWCO; 0.5ml）。每离心运行在〜14,000rcf并持续8-12分钟，或直到保留物体积小于100μl。
4. 混合总体积为〜20μl，以产生每个T盒茎干I RNA的200μM终浓度和快速冷却的tRNA在1x RNA结合缓冲液（见Recipes）中，孵育首先在50℃下进行10分钟，然后在37℃下在PCR上进行30分钟热循环器或加热块。使用加热盖尽可能减少冷凝和样品体积的改变。
5. 添加一个等效项（〜200μM最终）硒代甲硫氨酸 B （_{（Baird等人，2012）与mRNA-tRNA二元复合物偶联以形成1：1：1 三元复合物在10-40μl总体积。在室温下孵育 2分钟。}
6. 加入精胺至终浓度为2mM。的混合物可能变得暂时浑浊但应当快速澄清。混合轻轻地上下轻轻吹打
7. 熔化2％低熔点琼脂糖溶液在90℃加热块上并允许它在加热块上缓慢冷却至37℃以防止其固化。琼脂糖溶液可以在4℃下储存至少一个月多次重复使用。
8. 将T-box三元复合物和结晶溶液（见Recipes）的样品溶液1：1混合，保持在37℃。
9. 加入1/10体积的2％低熔点琼脂糖溶液，轻轻地通过吸移上下混合。琼脂糖纤维在晶体中的存在溶剂通道为晶体提供机械支撑（Biertumpfel et al。，2002; Lorber et al。，2009）。在这种情况下，0.2％低熔点琼脂糖有效地保护共晶严重开裂由于渗透压的突然变化脱水步骤。琼脂糖浓度范围为0.05％至0.5％已经测试，产生从流体到范围的各种一致性液体（<0.1％）至粘稠液体（〜0.1％），形成胶状固体（〜0.2％）至强固体（> 0.2％）。在我们的经验，果冻状固体稠度（〜0.2％）允许容易处理液滴，便于从琼脂糖网络上切下晶体，并提供足够的机械支撑晶体。
10. 在EasyXtal 15-Well Tool的容器中加入300-500μl结晶溶液。
11. 将结晶混合物（总体积1-2μl）转移到EasyXtal 15-well工具的盖玻片上
12. 将盖板滑动到EasyXtal 15-Well工具板上通过悬滴蒸汽扩散开始结晶实验。
结晶后处理
1. T-box-tRNA-YbxF三元复合物的方形板状晶体开始出现在几天。衍射质量晶体倾向于生长更慢，达到320×300×60μm的最终尺寸 3-4周的疗程。这些晶体属于空间群 C 222 ₁，带单位晶胞尺寸为a a = 108.7埃，b埃= 108.8埃，c em = 291.8埃。和许多人一样其他板状大分子晶体与一个相对较长晶胞边缘，这些晶体的 c轴与它们共线最短物理尺寸， i .e ，边缘或"rim" 矩形或菱形板的厚度。因此，振荡由穿过的入射X射线产生的衍射图像通过板的宽面遭受显着的重叠相邻反射。这种重叠可以通过使用来避开 90°弯曲的晶体环（MiTiGen环的定制弯曲），这限制了入射X射线仅通过它们进入和离开晶体边缘，但不是他们的板的面孔。
2. 取决于最终低熔点琼脂糖在结晶液中的浓度和温度，整个液滴可以显示多个一致性范围从流体，到粘稠，到果冻状，到坚固的固体。相应地选择适当的晶体操纵工具将晶体转移到玻璃中的100-200μl晶体处理溶液中凹陷板（设备）。使用常规尼龙环传递单晶从非粘性液滴，并使用工具如 MicroSieves（MiTeGen）转移完整，固化的液滴。收获从粘稠的软胶状液滴可能是低效的和技术上的具有挑战性，因此在可能的情况下最好避免。梯度浓度的主沉淀剂（20-50％PEG3350在5％增量），以获得最终溶剂含量的范围测量对衍射质量的影响。不同浓度的一组二价阳离子，特别是碱土金属（Mg 2+超导体，Ca 2+超导体，Sr超导体+超导体，Ba超导体+超导体），对于支撑晶体生长和用于后结晶处理。在T盒的情况下复合晶体，在Mg 2+存在下生长的晶体随后在Sr 2+中的后结晶处理显现出来最优程序（表1），产生圆形，良好分离的布拉格斑点。这种高质量的数据对于新的定相是必不可少的使用单波长异常色散（SAD）的复杂结构，利用存在于YbxF中的两个硒代甲硫氨酸蛋白。
3. 使用正方形密封凹陷板的每个孔玻璃盖玻片和凡士林。将晶体孵育在晶体中处理溶液（参见Recipes）在室温下处理16小时。为了晶体的T盒三元复杂，更短的治疗（即更少超过4小时）一般不会产生延长的充分效果治疗。通常，如果晶体表现出过度的物理损坏从治疗，可以通过连续减轻晶体的冲击通过几个中间晶体转移晶体处理溶液，其组成有递增变化。在里面情况下T型盒共晶，单步骤"冲击"处理与几个分步处理相比产生更好的结果，借助来自琼脂糖网络的机械支持
4. 小心地从他们周围的琼脂糖中解出晶体网络使用MicroSaws（MiTeGen），并删除尽可能多的琼脂糖可能没有物理损坏晶体（图1）。作为晶体环中晶体的取向对于还原是关键的在数据收集期间重叠，必须修剪几乎所有琼脂糖离开晶面以使板状晶体将平行于90°弯曲环的平面安装。我们推荐使用由软触感材料制成的微型工具塑料或聚合物，而不是金属工具。不自主的振动从拿着金属刮刀的手倾向于导致更严重的物理损坏晶体。 "双挥杆"两个塑料MiTeGen MicroSaw 在立体显微镜下似乎提供了自信的操纵同时最小化局部物理影响。
5. 使用90°弯曲环如成角度的MicroLoops或MicroMounts（MiTeGen），拾起单，修整晶体并立即插入液氮中玻璃化。因为水晶处理解决方案已经包含至少40％（w/v）聚乙二醇（PEG）3350，无额外需要冷冻保护剂。
了解治疗引起的晶体质量改善
1. 生长的未处理晶体的结构测定和数目的晶体经历后结晶的各种组合处理允许跟踪这些中的大分子运动晶体响应于施用的治疗（表1）（Zhang和 Ferre-D'Amare，2013; Zhang和Ferre-D'Amare，2014b）。
2. 结构未处理和最佳处理的晶体的对准揭示 T-box-tRNA-YbxF的三元复合物经历旋转和翻译作为在晶体中彼此更接近的准刚性体，生产优质包装接触包括几个亲密碱基堆叠相互作用的对称相关复合物以及工程RNA四核苷酸之间的I类轻微相互作用盖住tRNA受体茎和近端区的小沟的T型箱茎I（Zhang和Ferre-D'Amare，2014b）
3. 独特在T-box共结晶的后结晶处理中Sr ^{2 +}的影响可以部分地通过其与邻近对称性相关的T盒RNA的3'顺式 - 二醇的特异性结合来解释，其频率双齿内皮相互作用与Hoogsteen面对的嘌呤，其与磷酸盐聚集的凸起和结的结合，或桥接跨越A形式RNA螺旋的窄主要凹槽。的 Sr ^{2 +}结合RNA 3'末端的能力及其柔性配位几何形状是可以允许其改善结晶填充的性质的RNA（Hofer等人，2006）。

代表数据

表1.选择用不同程度的离子置换和脱水处理的晶体的性质

PDB代码	Li ₂ SO ₄ （mM）	MgCl 2（mM）	SrCl2（mM）	PEG 3350（％w/v）	分辨率（Å）	空间组	晶胞尺寸（Å）	v （³/Da）	V _S（％）
4TZP	300	20	0	20	8.5	C 222 ₁	108.7，108.8，291.8 ^*	3.26	74.6
4TZV	0	20	0	20	5.0		75.7，75.7，270.2 ^*	2.93	71.7
4TZW	0	0	50	20	4.7		75.3，75.3，268.9 ^*	2.89	71.3
4TZZ	0	100	0	48	3.6	P 2 ₁	70.6，260.7，70.7 ^†	2.46	66.3
4LCK	0	0	40	40	3.2	C 222 ₁	100.8，109.7，268.1 ^*	2.81	70.4

^*α=ß=Γ= 90°
^†α=Γ= 90°，ß= 92.8°
V _{M V _s计算溶剂含量

图1.在存在琼脂糖（a），处理（b）和解剖（c）后初始生长后T盒RNA结晶的外观。实线表示200μm。}

食谱

RNA结合缓冲液（1x）
50mM HEPES-KOH（pH7.0）
100 mM KCl
20mM MgCl 2/
5mM三（2-羧乙基）膦（TCEP）
20mM精胺溶液
在DEPC处理的水中
通过0.2 mm过滤器过滤
结晶溶液
50mM Bis-Tris（HCl）（pH6.5） 0.3M Li 2 SO 4。
20mM MgCl 2/
20％（w/v）聚乙二醇（PEG）3350
水晶处理解决方案
50mM Bis-Tris（HCl）（pH6.5） 100 mM KCl
20-50mM的SrCl 2或20-100mM的MgCl 2。 40-45％PEG3350
5mM TCEP

致谢

我们感谢ALS的光束线5.0.1和5.0.2以及APS的ID-24-C和ID-24-E的工作人员，特别是东北合作访问团队的K. Perry和KR Rajashankar（NE-CAT ）的APS用于支持数据收集和处理，以及N.Baird，C.Jones，M.Lau，A.Tol-Mecak和K.Warter的讨论。这项工作部分基于在伯克利结构生物学光束中心的ALS和在NE-CAT光束线上的APS（由国家综合医学研究所授予P41GM103403支持）进行的研究。美国能源部支持使用ALS和APS。 J. Zhang是NHLBI职业过渡奖（K22）的获得者。这项工作部分由NHLBI，NIH的内部程序支持。

参考文献

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Grundy，F.J。和Henkin，T.M。（1993）。 tRNA作为转录反转录的正调控子。 74 74（3）：475-482。
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Lorber，B.，Sauter，C.，Theobald-Dietrich，A.，Moreno，A.，Schellenberger，P.，Robert，MC，Capelle，B.，Sanglier，S.，Potier，N.and Giege，（2009）。凝胶中蛋白质，核酸和病毒的晶体生长 Biophys Mol Biol 101（1-3）：13-25
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