材料和试剂

肝癌细胞系：Huh-7（JCRB，目录号：JCRB0403），HepG2（ATCC，目录号：HB-8065），SNU-398（ATCC，目录号：CRL-2233）和SNU-449 目录号：CRL-2234）
DMEM（生命技术）
RPMI（生命技术）
无氨基酸培养基，不含胎牛血清，称为Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich）
胎牛血清（Cultek）
青霉素和链霉素（Life Technologies，Gibco ）
100x非必需氨基酸解决方案（生命技术）
RNAiMAX（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：13778030）
OptiMem（Life Technologies，目录号：11058021）
非沉默小干扰RNA对照（siCt1）和小干扰RNA芳基甲酰胺酶（siAFMID）（GE Healthcare Dharmacon，目录号：L-HUMAN-XX-00055nmol）
NAD + - [羰基-14C]（Perkin Elmer，目录号：NEC831010UC）
L- [苯环-U-14C] - 色氨酸（Moravek，目录号：MC 2335）
PEI-纤维素薄层色谱（TLC）（20×20cm的F板）（Merk Millipore目录号：105725）
乙酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A1542）
乙醇和甲醇（Sigma-Aldrich）
NAD ⁺ - [羰基-14C]（参见配方）
L- [苯环-U-14C] - 色氨酸（参见配方）
细胞密度（约60-80％）（参见配方）

设备

荧光图像读取器（Molecular Dynamics，型号：Storm820）
荧光图像筛（GE Healthcare Dharmacon，目录号：63-0034-79）
Speedvac离心机（Thermo Fisher Scientific）
4℃台式离心机（Eppendorf，型号：5424R）
处理放射性物质的通风橱
细胞刮刀（Corning Incorporated，目录号：3008）
标尺

软件

斐济软件（www.fiji.sc/Fiji）

程序

四种肝癌细胞系：Huh-7，HepG2，SNU-398和SNU-449。
1. Huh-7，HepG2，SNU-398和SNU-449细胞在10cm细胞中培养培养皿在完全DMEM（Huh-7和HepG2细胞）和 RPMI培养基（SNU-398和SNU-449）。两种培养基补充有10％胎牛血清和100单位/ml青霉素和0.1mg/ml 链霉素
2. 所提供的体积是12孔板的一个孔，并且应该根据孔的大小缩放：200μl 将Optimem与1.2μl的siAFMID或siCtr轻轻混合。这个混合物加入1.6μlRNAiMAX中并在室温下温育在井中20分钟。
3. 轻轻重悬Huh-7，HepG2（8.0 x 10×10 4个）细胞在1,000μl的DMEM或SNU398，SNU449（3.5×10 4个）细胞中的 1,000μlRPMI培养基，并将这些细胞添加到RNAiMAX混合物中。的在该步骤中使用的不同单元格数目是绕过变量生长速率在我们的细胞培养条件下获得类似的细胞转染实验后的数字
4. 24小时后，细胞培养基更换为含有10％胎牛的DMEM或RPMI培养基血清和100单位/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素除去上清液。
5. 4小时后，除去培养基 1ml补充有非必需氨基酸（1x）的HBSS培养基加入到细胞培养物中。
在HBSS中和在非必需氨基酸存在下将2.5mM的L- [苯环-U-14C] - 色氨酸加入细胞培养物中。将细胞在37℃下孵育5小时
通过弃去上清液除去细胞培养基，然后将细胞用冰冷的PBS洗涤3次
使用200μl的80％甲醇和20％的水混合物，通过废弃和用力吸取提取亲液代谢物。将混合物在4℃下孵育10分钟
然后将全细胞提取物在4℃以20,000×g离心20分钟。
将提取物在speedvac离心机中浓缩，从200μl的80％甲醇和20％水（步骤4）（其可能需要一小时，通过增加真空压力可以减少时间）的最终体积为40μl，随后点在PEI-纤维素薄层色谱（TLC）F板上
1. 注释PEI-纤维素薄层色谱（TLC）F板
  1. 用铅笔在平板底部上方1厘米处画一条直线。
  2. 如图1所示，以2厘米的间隔，将代谢样品彼此等距离放置标记。
    
    图1.准备PEI-纤维素薄层色谱（TLC）F板进行测定
  3. 使用1μlNAD + - [羰基-14C]作为阳性对照斑点在最后一个泳道中以校准标记的相对迁移代谢物
  4. 添加5微升的代谢提取物从步骤6，让现场干燥。对所有样品重复此循环，直到整体提取物被点样。
2. 安装TLC迁移室
  1. 使用一种装置，用于将凝胶用于大型Western印迹作为TLC室
  2. 用70％乙醇擦拭TLC室。
  3. 填充代表迁移缓冲区的下层托盘如过程的第7点所述，如图2所示。
    
    图2.安装TLC迁移室
3. 用含有迁移缓冲液的PEI-纤维素TLC板设置TLC室
  
  图3.使用含有迁移缓冲液的PEI-纤维素TLC板（在步骤7中的组成）设置TLC室
  1. 小心地安装TLC板，其中板的底部浸没在迁移缓冲液中（步骤7中的组成）。但是斑点样品不应直接接触迁移缓冲区
  2. 板垂直安装在迁移缓冲液上（步骤7中的组合物），并通过粘着抑制任何移动它到顶部使用磁带。
在底部储存器中使用由接触0.5cm PEI-纤维素TLC F板的1M乙酸铵（pH 5）（30％）和无水乙醇（70％）组成的迁移缓冲液用于流动相。
在从起始线达到约15cm的5-6小时的迁移后，将纤维素板空气干燥并暴露于辐射敏感磷光体成像器屏幕过夜。使用Strom-820荧光图像读取器显示屏幕

图4.在四种不同的肝癌细胞系中衍生自L- [14 C] - 色氨酸的放射性标记的代谢物的TLC。来自siCtr和siAFMID的代谢物同时彼此相邻地加载。 [14 C] -NAD ⁺用作来自L- [14 C] - 色氨酸的标记的NAD ⁺的相对迁移的校准对照（Tummala等，2014）。

笔记

使用4种不同的肝肿瘤细胞系进行实验至少4次，并且该印迹是这4个不同实验的代表。已观察到标记物的一致掺入。斐济软件（ www.fiji.sc/Fiji ）用于量化图像中不同波段的像素化并且相对于siCtr样品校准相对带强度。数据解释应当基于正确大小的条带的强度进行，更大的是条带强度，并且更大的是NAD ⁺含量。

食谱

作为相对迁移标准使用的NAD + Supp + + [羰基-14C]，然而，并不强制使用这种特定的同位素，任何其它荧光成像剂敏感的NAD + sup/+同位素可用于此目的。
已经特别选择了L- [苯环-U-14C] - 色氨酸，因为色氨酸的苯环碳原子对NAD ⁺主链已知的贡献。
在饥饿时的细胞密度（约60-80％）产生最一致的结果。细胞不是新解冻，而是在解冻后保持在培养物中至少2-3代注意：这种方法在其他细胞系中没有验证，但是可以容易地适用于分析不同癌细胞系对新细胞系的依赖性 em> ⁺

致谢

该方案根据之前报道的方法改变（Merdanovic等人，2005）。 N.D是西班牙语Ramóny Cajal奖学金的接受者。这项工作由西班牙经济和竞争力部（SAF2010-18518），国际癌症研究协会AICR英国（11-0242），CNIO（BC1104-08）和欧洲糖尿病研究基金会（EFSD ）。

参考文献

Merdanovic，M.，Sauer，E。和Reidl，J。（2005）。 NAD ⁺生物合成与烟酰胺核糖基转运的偶联：NadR的表征流感嗜血杆菌的核糖核苷酸激酶突变体。细菌 187（13）：4410-4420。
Tummala，KS，Gomes，AL，Yilmaz，M.，Grana，O.，Bakiri，L.，Ruppen，I.，Ximenez-Embun，P.，Sheshappanavar，V.，Rodriguez- Justo，M.，Pisano，DG ，Wagner，EF和Djouder，N。（2014）。通过致癌性URI抑制新的NAD（+）合成导致肝脏通过DNA损伤的肿瘤发生。癌细胞 26（6）：826-839。