材料和试剂

1/2X Murashige和Skoog（MS）培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
Bacto Agar [Becton，Dickinson and Company（BD），目录号：2140101]
拟南芥（Arabidopsis thaliana）苗，其表达与荧光蛋白融合的高尔基体定位的蛋白质（例如 35S :: ST-mRFP :: ERD2-GFP in col， pGNL1 :: GNL1-YFP in gnl1 ， pGNOM :: GNOM-GFP in gnom ）
抑制剂[诸如BrefeldinA（BFA）（Sigma-Aldrich，目录号：B7651），莫能菌素（Sigma-Aldrich，目录号：M5273），沙利霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S4526）
二甲基亚砜（DMSO）（Wako Chemicals USA，目录号：046-2198）
冷冻型B型（Ted Pella，目录号：39201）
蔗糖（Wako Chemicals USA，目录号：196-00015）
1.8ml冷冻管[例如：Nunc cryotubes（Sigma-Aldrich，目录号：V7884-450EA）]
甲基丙烯酸酯类树脂（Lowicryl HM20树脂试剂盒）（Electron Microscopy Sciences，目录号：14340）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S8282-500G）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907-100G）
液氮
0.5％Formvar溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：15820）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379-25ML）
针对荧光标签的初级抗体[例如绿色荧光蛋白（GFP）]
与金纳米颗粒（直径5,10或15nm）结合的二抗
低温替代溶液（参见配方）
柠檬酸铅（参见配方）
铀酰乙酸溶液（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）储备溶液（10x）（见配方）
0.1％Tween-20的PBS溶液（PBS-T-0.1％）（参见Recipes）
0.5％Tween-20的PBS（PBS-T-0.5％）（参见Recipes）
阻止缓冲区（参见配方）
HM20树脂溶液（见配方）
柠檬酸铅（参见配方）
铀酰乙酸溶液（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）储备溶液（10x）（见配方）
0.1％Tween-20的PBS溶液（PBS-T-0.1％）（参见Recipes）
0.5％Tween-20的PBS（PBS-T-0.5％）（参见Recipes）
阻止缓冲区（参见配方）
HM20树脂溶液（见配方）
... 柠檬酸铅（参见配方）
铀酰乙酸溶液（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）储备溶液（10x）（见配方）
0.1％Tween-20的PBS溶液（PBS-T-0.1％）（参见Recipes）
0.5％Tween-20的PBS（PBS-T-0.5％）（参见Recipes）
阻止缓冲区（参见配方）
HM20树脂溶液（见配方）
...... 柠檬酸铅（参见配方）
铀酰乙酸溶液（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）储备溶液（10x）（见配方）
0.1％Tween-20的PBS溶液（PBS-T-0.1％）（参见Recipes）
0.5％Tween-20的PBS（PBS-T-0.5％）（参见Recipes）
阻止缓冲区（参见配方）
HM20树脂溶液（见配方）
......... 程序
1. 使用共聚焦显微镜实时成像高尔基体此协议适合于执行植物细胞的长期实时成像。
  1. 将种子放在1/2X MS培养基上，用0.8％Bacto琼脂固化，并在22℃下在连续光照下垂直生长4-5天。
  2. 收集4-5天的拟南芥幼苗并将其转移到1/2X MS培养基用0.8％Bacto琼脂固化，包括抑制剂或控制DMSO溶剂注意：防止损伤根细胞拟南芥幼苗，通过保持转移拟南芥幼苗推荐使用轻质镊子的子叶。抑制剂库存溶于DMSO中，因此相应量的DMSO应该是包含在对照培养基中。抑制剂的工作浓度根据所分析的化学品和细胞类型而变化，但通常是这样 10-100μM。
    
    图1.使用拟南芥幼苗制备用于长期活细胞成像的标本。 A.所需材料。双。样品制备用于成像拟南芥细胞。
  3. 将拟南芥幼苗和固体培养基转移到 Lab-Tek Chambered Coverglass。幼苗应夹在中间盖玻片和固体介质（见视频1和图1）
    
    视频1.使用拟南芥幼苗进行长期活细胞成像的标本准备
    
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  4. 将准备好的Lab-Tek Chambered盖玻片放在装有63x或100x物镜的倒置共聚焦激光显微镜上
  5. 聚焦标本并观察细胞注意：观察靠近盖玻片的细胞，例如表皮细胞，可以提供更好的图像。用于执行长期时间流逝成像，确保目标不干透。防止水浸渍物镜干燥，放置一滴Zeiss Immersol W 直接在目标或盖玻片上作为浸没介质。作为一个高尔基体标记，荧光标记的ERD2，ST，COPI蛋白可以使用（Naramoto等，2014）。请注意这个实验设置允许有限的气体交换，这可能影响几个过程在植物中。长期成像的替代方法包括成像室或植物的微流体装置（Busch等人， 2012）。
2. 使用TIRF显微镜进行高尔基体定位的蛋白质的详细的活体成像分析该协议适合于可视化细胞表面周围的蛋白质的细胞亚细胞定位
  1. 将种子放在1/2MS固体培养基（0.8％Bacto琼脂）上，并在连续光下在22℃下垂直生长7天。
  2. 将7日龄拟南芥幼苗转移到1X MS液体培养基中并孵育超过30分钟。如有必要，抑制剂或可以加入DMSO对照溶剂。
    注意：孵育时间可能因实验而异，但通常为30分钟至2小时。
  3. 通过使用细剪刀或手术刀（见图2）从7日龄拟南芥苗培育根或下胚轴段。
    
    图2.用于TIRF显微镜成像的拟南芥根的切除。 7天的拟南芥幼苗。 B.7天大的拟南芥幼苗，由剪刀切除。在根或下胚轴处的切除位置是用白色虚线表示。
  4. 使用玻璃载玻片和盖玻片用液体培养基安装根部或下胚轴段。
  5. 将准备好的样品放在装有油的TIRF显微镜上浸没式CFI Apo TIRF 100x H/1.49数值孔径物镜
  6. 聚焦样本并观察细胞注意：只有与盖玻片表面接触的细胞可以成像。对于根，细胞在伸长区，特别是那些靠近到分化区，适合观察。请参见例如定位于高尔基体的pGNOM :: GNOM-GFP的TIRF图像（见视频2）。
    
    视频2.通过本协议中描述的TIRF显微镜定位于高尔基体的GNOM-GFP的活体成像
3. 通过使用TEM免疫金标记高尔基体本地化的蛋白质
  1. 将秧苗在1/2MS板上生长并表达a 荧光标记的高尔基定位的蛋白质在一滴0.1M蔗糖中。切割1毫米长的根段，并将其放置在冷冻棘轮内（图3A）。除转基因根表达荧光标记蛋白，也处理野生型样品在免疫标记期间用作阴性对照。
    
    图3。制备用于免疫金标记的根样品。 A.冷冻高压冷冻平台。 B.安装HM20树脂嵌入根在桩上切片。
  2. 将另一个冰柜平面顶部，平面朝下放置，关闭室。
  3. 在高压冰箱中冻结包含根段的两个平面
  4. 在液氮下，分开两个平板并转移一个含有冷冻根到具有冷冻取代的冷冻管解决方案
  5. 放置冷冻管与冷冻补液溶液和样品置于预冷却至-90℃的冷冻置换装置中。样品应保持在-90°C至少3天。
  6. 提高冷却装置的温度为-60℃。去掉冷冻取代溶液，并用新鲜，预冷却（〜60℃）冲洗样品 ℃）无水丙酮3-4次。使用删除空冷冻平面预冷镊子（所有根段应从中分离平面和自由内部在冷冻管与丙酮）。
  7. 去掉丙酮并加入预冷（-60℃）30％HM20溶液至少3小时。用预冷却（-60℃）的60％HM20溶液（3小时）和重复该步骤 100％HM20（3h）。建议使用100％HM20进行至少3次更改。在整个嵌入过程中，样品应保持在-60 ℃。
  8. 通过连接Coverwell ^®成像组装嵌入室室到玻璃载玻片。填充与新鲜100％HM20的嵌入室并将根从冷冻管转移到包埋室。封面用玻璃盖玻片
  9. 在-50℃下用UW光聚合HM20树脂48小时
  10. 一旦聚合，从嵌入室去除树脂块。在解剖的帮助下找到树脂块内的根显微镜。切割块或树脂含根，并将其安装在顶部的树脂桩使用超级胶水（图3B）
  11. 用剃刀刀片修剪树根块周围的树脂块。开始用玻璃切片刀在超薄切片机中直到到达根部。切换到钻石刀; 在Formvar涂层镍网上收集70nm厚的部分
    
    图4.用抗GFP抗体对GNOM-GFP进行免疫金标记高压冷冻取代的拟南芥根。 A.检测的GNOM-GFP在DMSO中处理3分钟的转基因根。 B.检测的GNOM-GFP在BFA中处理3分钟的转基因根。 C.负面对照：用DMSO处理3分钟的野生型根。箭头表示金颗粒。 G，Golgi; MVB，多泡体。 TGN，Trans 高尔基网络。比例尺= 200nm。修改自Naramoto等人（2014）版权所有美国植物生物学家协会
  12. 地方10 μl的封闭缓冲液在一块石蜡膜和浮法镍上网格在滴的顶部（根部应该与封闭缓冲液）15-20分钟。
  13. 转移网格到10微升的一抗在封闭缓冲液（推荐的稀释度：1:10到1:50）稀释1小时。
  14. 在PBS-T-0.5％缓冲液流下漂洗网格1分钟。污点网格用滤纸和浮动他们在10微升次要抗体溶液（建议稀释度1:10至1：100）1小时。
  15. 用PBS-T-0.5％缓冲液冲洗网格1分钟，然后用蒸馏水冲洗
  16. 用乙酸铀酰溶液染色根切片10分钟，然后用柠檬酸铅染色5分钟。
  17. 在透射电子显微镜中观察切片（图4）。
食谱
1. 低温替代溶液
  0.2％戊二醛加0.2％乙酸双氧铀在丙酮中的溶液将1.5 ml置于2ml冷冻管中，并将单个等分试样储存在液氮中
2. 柠檬酸铅
  1. 戴手套处理硝酸铅
    煮沸50ml蒸馏水以除去CO 2（CO 2溶解于水中可导致该溶液沉淀），并让水在室温下冷却
  2. 向10ml蒸馏水中加入0.33g硝酸铅，轻轻混合直至硝酸铅晶体完全溶解
  3. 加入0.44克柠檬酸钠，轻轻混匀; 溶液将变成乳白色
  4. 加入2ml用煮沸水新鲜制备的1N氢氧化钠溶液; 该解决方案将变得透明
  5. 用蒸馏的蒸馏水将体积调至12.5ml
  6. 将溶液储存在室温或4℃下
3. 乙酸铀酰溶液
  2％乙酸双氧铀（w/v）在30％甲醇（v/v）中的溶液
4. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）储备溶液（10x）
  将1.76g的NaH 2 PO 4，11.49g的Na 2 HPO 4，85g的氯化钠溶于1ml二氯甲烷中， L的蒸馏水，pH6.8（在室温下保存）
5. 0.1％Tween-20的PBS溶液（PBS-T-0.1％）将100μlTween-20加入100 ml 1x PBS中
  用移液器上下移动几次将Tween-20移出移液管吸头，进入PBS-T-0.1％溶液中
6. 0.5％Tween-20的PBS溶液（PBS-T-0.5％）将5毫升Tween-20加到1升1×PBS中
7. 阻塞缓冲区
  10％（w/v）脱脂奶粉的PBS-T-0.1％
8. HM20树脂溶液
  根据制造商的说明在护罩中准备HM20树脂
  通过与适当体积的无水丙酮混合，制备30％和60％HM20树脂溶液（v/v）
致谢

这项工作是从住友基金会到SN的基础科学研究项目的拨款支持;日本科学促进会（JSPS; 30612022 to S.N.）;日本教育，文化，体育，科学和技术部[NC-CARP项目（到S.N.）]和美国国家科学基金会授予MCB1157824（MSO）。

参考文献
1. Busch，W.，Moore，BT，Martsberger，B.，Mace，DL，Twigg，RW，Jung，J.，Pruteanu-Malinici，I.，Kennedy，SJ，Fricke，GK，Clark，RL，Ohler，和Benfey，PN（2012）。用于基因表达的高通量实时成像的微流体装置和计算平台。 > Nat Methods 9（11）：1101-1106。
2. Naramoto，S.，Otegui，MS，Kutsuna，N.，de Rycke，R.，Dainobu，T.，Karampelias，M.，Fujimoto，M.，Feraru，E.，Miki，D.，Fukuda， Nakano，A。和Friml，J。（2014）。观察膜运输调节剂GNOM ARF-GEF在拟南芥中的高尔基体的定位和功能。。 Plant Cell 26（7）：3062-3076。