材料和试剂

小鼠C57BL/6雄性（年龄8-12周）
Difco Fluid硫代乙醇酸盐培养基（BD，目录号：225650）
70％和100％乙醇
PBS（Lonza，目录号：BE17-515Q）
RPMI 1640（Lonza，目录号：BE 12-115F）
FBS（内毒素<10EU/ml）（Hyclone，目录号：SV30160.03）
青霉素 - 链霉素（Lonza，目录号：BE17-602E）
鼠IL-4（Peprotech，目录号：214-14）
Tris（Panreac Applichem，目录号：131940.1211）
NaCl（Merck KGaA，目录号：1.06404.1000）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：ED255）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：8787）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
脲（Sigma-Aldrich，目录号：4883）
MnCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：244589）
L-精氨酸一盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：A6969）
H 2 SO 4（Sigma-Aldrich，目录号：320501）
H sub 3 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：345245）
异丙基苯丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：I3502）
12孔板
1.5 ml Eppendorf管
50ml无菌Falcon管
细胞过滤器（Becton Dickinson，目录号：352340）
10毫升注射器
21G针
25G针
裂解缓冲液（见配方）
热灭活FBS（参见配方）
停止解决方案（参见配方）

设备

台式冷冻离心机
剪刀
培养箱（37℃，5％CO 2和95％湿度）
组织培养罩（生物安全柜）
光学显微镜
Neubauer细胞计数室
分光光度计读数器
热块（Eppendorf Thermomixer Compact）或水浴

程序

将甲糖醇注入腹膜
1. 制备3％巯基乙酸盐培养基。
  1. 将30克巯基乙酸盐培养基悬浮在1000ml无热原水中
  2. 等分到100毫升无菌瓶。
  3. 高压灭菌（15 psi/121°C/15 min）。
  4. 冷却后，在室温下避光保存2个月后使用。
    注意：硫代乙醇酸盐溶液需要老化几个星期，直到它颜色变为棕色。这个过程是重要的增加腹膜细胞外渗。
2. 注入2.5ml的3％巯基乙酸盐培养基i.p. 每只小鼠使用具有25G的10ml注射器针。等待4天，收获腹膜细胞（见步骤B）。
巯基乙酸钠的分离和培养引发腹膜巨噬细胞
1. 牺牲小鼠与CO 2或异氟烷（使用颈脱位不在本协议中指示，以避免潜在的内部出血）。
2. 用70％乙醇清洁腹部。
3. 去除皮肤暴露腹膜壁。在皮肤上做一个小切口，并牢固地拉紧
4. 用25 G针将10ml RPMI 1640注入腹膜腔
5. 按摩腹部约30秒。
6. 使用10毫升注射器尽可能多的恢复腹膜液用21 G针。（通常约8-10ml液体即可从一只老鼠恢复。）
7. 从注射器中取出针头，将液体放入冰上的50ml锥形离心管中
8. 在300×g（1,500rpm，4℃）下离心腹膜细胞5分钟。弃去上清液并收集沉淀。
9. 重悬细胞沉淀在10 ml RPMI 1640培养基和计数细胞。（通常可以从一个回收约3,000-50,000,000个细胞鼠标。）
10. 在12孔培养物中培养腹膜细胞（1×10 6个/cm 2/cm 2）平板在1ml含有10％热灭活的FBS的RPMI中 5％CO 2 3小时。
11. 通过用含有10％热灭活的FBS的RPMI在37℃下彻底清洗去除非贴壁细胞
12. 在每孔1ml RPMI 2％FBS存在下进行过夜细胞饥饿。
M2激活腹膜巨噬细胞
1. 细胞饥饿后，保持细胞在RPMI 2％FBS和刺激通过向12孔板中加入IL-4（20ng/ml）并孵育来诱导巨噬细胞在37℃下培养24小时。
精氨酸酶活性测量
1. 对于细胞解离，用PBS洗涤细胞一次，并在室温下加入适当体积的裂解缓冲液（参见Recipes）。
  注意：通常在每个12孔板中200μl。
2. 用细胞刮刀除去细胞，收集到一个1.5毫升 Eppendorf和移液器上下5次用200μl提示完成悬挂。
3. 在4℃下裂解细胞15分钟。
4. 然后旋转在4℃下以全速（10分钟，14,000rpm，16,800×g）洗涤细胞裂解物并分离上清液。使用前保存于4°C。
5. 同时，在50mM Tris-HCl（pH7.5）中制备8M尿素储备液
6. 稀释尿素在50mM Tris-HCl（pH7.5）中的储备液以产生标准物范围为25至1,500μg/ml。（例如25,50,100,250,500,1,000和1,500） μg/ml）
7. 转移50微升的细胞裂解液和标准品2毫升 Eppendorf管中，加入50μl在50mM Tris-HCl中稀释的10mM MnCl 2 （pH7.5）。
8. 孵育管在热块或水浴中在55°C下10分钟，以触发精氨酸酶-1活性。
9. 然后向管中加入50μl的0.5M L-精氨酸并在37℃下孵育热块或在37℃水浴60分钟。这个步骤诱导精氨酸水解
10. 通过加入400μl终止溶液（H 2 SO 4 SO 4/H 3 PO 4/H）终止反应 O = 1/3/7，v/v/v）。
11. 接下来，加入50μl的9％异壬基苯丙酮在100％乙醇中每个样品和标准品，并在100℃的热块中孵育试管 ℃60分钟。
12. 将试管在黑暗中室温放置30分钟。
13. 转移100微升/孔的样品和标准品一式三份到a 96孔板，在540nm用690nm读取光密度更正。
14. 根据标准计算样品浓度曲线并使用下式转化为精氨酸酶单位：[尿素产生的（μg/ml）/总蛋白（μg/ml）]。

食谱

裂解缓冲液
20mM Tris（pH7.5） 150mM NaCl 2mM EDTA 0.1％Triton X-100 蛋白酶抑制剂混合物1μg/ml
热灭活的FBS
在55℃下使FBS失活30分钟
以等分试样储存在-20℃下
停止溶液（11 ml）
H SO 1 ml
H ₃ 4 3 ml
H 2 O 7ml

致谢

这项研究由来自FIS的授权PI11.0036和来自ISCIII到SH的MPY1410/09以及通过授予TPY-M-1068/13到AL支持。 AL由MINECO-ISCIII通过Miguel Servet计划（CP12/03087）提供支持。 L.J-G。由FIS（FI12/00340）支持。该协议改编自Jimenez-Garcia等人（2015）。
注意：根据ISCIII批准的方案进行研究。

参考文献

Jiménez-García，L.，Herránz，S.，Luque，A。和Hortelano，S。（2015）。 p38 MAPK在IL-4诱导的腹膜巨噬细胞的替代活化中的关键作用。 Eur J Immuno 45（1）：273-286。