材料和试剂

拟南芥种子（ Arabidopsis thaliana L。）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D9434）
放射性标记的葡萄糖[葡萄糖D-葡萄糖（U）]（American Radiolabeled Chemicals，目录号：ARC 0122D）
乙酸，冰川（Certified ACS）（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
硝酸，Fuming（Certified ACS）（Fisher Scientific，目录号：A202-212）
计数鸡尾酒（Biodegradable Scintillation Cocktails）（Biosafe II，目录号：111195）
去离子无菌水（在120℃高压灭菌30分钟）
Murashige& Skoog（MS）基础盐混合物（ Phyto Technology Laboratories ，目录号：M524）
MES一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：69889）
型号A307样品氧化剂（PerkinElmer，目录号：A030700）
铝箔
Eppendorf管（1.5ml）（在120℃高压灭菌30分钟）
MS介质（参见配方）
乙酸硝酸试剂（见配方）

设备

Eppendorf管支架
巴斯德吸管和提示
1L锥形烧瓶（在120℃高压灭菌30分钟）
微观
轨道振动器
微量离心机
玻璃闪烁管（20ml）
闪烁计数器（Packard Tri-Carb液体闪烁计数器）
高压灭菌器

程序

设置（注1和2）
1. 在1.5ml Eppendorf管中，加入拟南芥种子（〜100mg种子=〜2 g的幼苗湿重）和表面灭菌。简而言之，在层流中流动罩，加1ml 30％家用漂白液补充 20μl的5％v/v十二烷基硫酸钠（SDS）并摇动15分钟。去除漂白剂上清液，种子沉降在底部然后依次用1ml高压灭菌器洗涤三次去离子水。取出最终的洗涤溶液，并等分500微升灭菌水倒入Eppendorf管中。将种子转移至4℃ 冰箱和商店在黑暗中2天促进均匀发芽。
2. 准备两瓶液体MS培养基（250ml）有和没有葡萄糖（2％w/v）。在液体中高压灭菌在120℃下循环30分钟。
3. 添加种子和冷却和灭菌的MS培养基补充2％葡萄糖到预灭菌的1 L锥形烧瓶。
4. 放置并将烧瓶固定在轨道上摇动并搅拌（180rpm）混合物2小时，以促进发芽。然后，用铝箔包裹烧瓶以防止光穿透。将烧瓶放回振荡器并搅拌72 H。（注3）。
实验程序
注意：幼苗需要保持在黑暗中从步骤B5-8。
1. 72小时后，取出葡萄糖补充培养基并洗涤幼苗去除所有痕量的葡萄糖（注4）。描述幼苗如何应该如图1所示。
  
  图1.黑暗生长的表示 etiolated的拟南芥幼苗，其在液体MS培养基中生长 72小时。正方形等于1厘米。
实验程序
注意：幼苗需要保持在黑暗中从步骤B5-8。
1. 72小时后，取出葡萄糖补充培养基并洗涤幼苗去除所有痕量的葡萄糖（注4）。描述幼苗如何应该如图1所示。
  
  图1.黑暗生长的表示 etiolated的拟南芥幼苗，其在液体MS培养基中生长 72小时。正方形等于1厘米。
2. After treatment, remove unincorporated radiolabeled glucose by centrifuging for 10 min at max speed and decant supernatant. Then add 1 ml of water, centrifuged for 10 min at max speed, and decant supernatant (Note 11). Repeat twice.
3. Bring a water bath to boil.
4. Add 0.5 ml of acetic-nitric acid regent in each tube.
5. Submerge closed tubes in boiling water bath for 30 min.
6. Let samples cool, then centrifuge for 15 min at max speed. Carefully remove 400 µl of supernatant and place into a scintillation vial. This is a representative sample of the soluble cell wall fraction. While removing supernatant make sure not to disturb the pelleted insoluble fraction (Note 12).
7. Next, wash the remaining sample to remove radioactivity that was not incorporated into the insoluble fraction. Wash each sample with 1 ml of water, centrifuged for 10 min at max speed, and carefully discard supernatant. Repeat 2 more times.
8. Re-suspend pelleted material with 1 ml of water and transfer it to a scintillation vial. The insoluble fraction is considered cellulose (Updegraff, 1960) (Note 13).
9. 加入10和5毫升闪烁混合物到含有不溶性和可溶性材料的小瓶中，分别。将小瓶放在闪烁计数器中，然后选择用于^{14的适当程序以确定每分钟的崩解（dpm）。包括只含有闪烁鸡尾酒的空白确定背景放射性计数（注14）。}
10. 分析结果。

笔记

重要的是，步骤1至4在无菌环境中进行，并且所有生长培养基保持无菌
在步骤B11之前将幼苗保持在黑暗中是非常重要的
这个时间是重要的，因为下胚轴迅速伸长并需要大量的葡萄糖
将olated化的幼苗放置在种子清洗筛中，随后用去离子水洗涤
如果需要，幼苗 - 湿重量可以改变;然而，需要大量的幼苗来吸收统计学上相关的放射性量
保持你的重量在所有管之间相似（复制）是非常重要的。如果不是，这将对放射性摄取量具有显着影响。如果你这样倾向，你可以将数据显示为dpm gram ^-1。每个试管是试验中的独立复制。我们建议至少每次治疗使用3个分析重复，并及时重复实验
排出大部分过量的水，并将一小部分的乙醇幼苗放置在培养皿中。一次填充三个管，然后使用新的子集的子集。在这个步骤中，我们依靠来自标尺显示的光源作为只有光源
需要大于1μCiml -1 sup -1的放射性标记葡萄糖来检测不溶性级分中的放射性而不是闪烁计数器中的背景噪声（> 400dpm）。
至少应使用2倍速率，但我们建议饱和20倍速率。 X等于将下胚轴或根生长减少50％（GR 50）的速率，并且应当在剂量响应实验中预先确定。例如，异恶唑的GR 50为〜5nM，因此使用100nM浓度。化合物载体和对照，DMSO，不应超过溶液的0.01％。在较高浓度的DMSO可能对幼苗生长有害。
2小时时间点对于确定纤维素生物合成的抑制是否是药物作用模式的直接作用是重要的。
使用水去除过量的放射性，重要的是MS培养基或硫酸不与计数鸡尾酒溶液混合。
选择400μl作为可溶性级分的代表性样品，因为剩余的溶液难以除去而不除去潜在的不溶性级分（纤维素）。
转移可以通过切除1毫升的提示和移液器的尖端帮助
重要的是混合物大于混合物的75％，否则溶液将变得混浊并且计数将是不可能的。如果发生这种情况，稀释到另一个小瓶中，并添加计数总和
该方法仅适用于72小时的拟南芥幼苗。为了测量较厚组织（例如草根）中的不溶性级分，应首先在氧化剂中燃烧组织。捕获所产生的CO 2 CO 2并将其冲洗到小瓶中以在闪烁计数器中计数。

食谱

MS媒体
1. 半MS（Murashige和Skoog）基础盐培养基（2.32g/L）
2. MES一水合物（0.6g/L）
3. 用5M KOH调节pH至5.7
乙酸 - 硝酸试剂[乙酸：硝酸：水（8:1:2）]
将15ml浓硝酸加入到150ml 80％乙酸中

致谢

上述方法改编自Heim等人（1990）的方案，并由Brabham等人（2014）使用。这项工作得到了美国能源部的支持（批准号为DOE-FOA 10-0000368，S.D.和C.B.），美国农业部（Hatch Act grant to S.D.and J.S.）

参考文献

Brabham，C.，Lei，L.，Gu，Y.，Stork，J.，Barrett，M。和DeBolt，S。（2014）。 Indaziflam除草作用：有效的纤维素生物合成抑制剂植物生理 em> 166（3）：1177-1185。
Heim，D.R.，Skomp，J.R.，Tschabold，E.E。和Larrinua，I.M。（1990）。 Isoxaben抑制拟南芥中酸不溶性细胞壁物质的合成。 Plant Physiol 93（2）：695-700。
Updegraff，D.M。（1969）。半定量测定生物材料中的纤维素。 Anal Biochem 32（3）：420-424。