材料和试剂

成年小鼠脑/脊髓
4％多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
戊二醛溶液（GA）（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
二甲胂酸钠缓冲液（0.4M，pH7.2）（Electronic Microscopy Science，目录号：11654）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（1x Solution，Fisher BioReagents）（Fisher Scientific，目录号：BP2438-4）
铁氰化钾（III）（Sigma-Aldrich，目录号：702587）
硫代碳酰肼（TCH）（Electronic Microscopy Science，目录号：21900）
四氧化锇4％溶液（Electronic Microscopy Science，目录号：19150）
醋酸铀（UA）（Electron Microscopy Sciences，目录号：22400）
硝酸铅（结晶/Certified ACS），Fisher Chemical（Fisher Scientific，目录号：L62-100）
L-天冬氨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A9256）
乙醇，200标准（100％），USP，Decon Labs（Fisher Scientific，目录号：07-678-004）
丙酮（电子显微镜科学，目录号：10010）
EMbed-812试剂盒（Electronic Microscopy Sciences，目录号：14120）
EMS成型平嵌入模具（Electronic Microscopy Sciences，目录号：70905-01）

设备

Vibratome（Leica，目录号：Leica VT1000S）
Zeiss Sigma VP SEM（Zeiss）与Gatan 3View（Gatan）

图1. Zeiss Sigma VP SEM（Zeiss）with Gatan 3View（Gatan）

程序

在1-2分钟内用20 ml PBS在心脏内灌注小鼠，然后在5分钟内用含有1％GA的50ml 4％PFA灌注。
解剖出小鼠脑/脊柱，并用4％PFA和1％GA在4℃下后固定24小时。
从脊柱剥离脊髓。
固定的脑/脊髓切片在振动器上制成100μm厚度。
根据感兴趣的区域，将脑/脊髓切片切成0.2×0.2cm 2的组织块。
将组织块置于1.5ml Eppendorf管中，并在1ml冷（4℃）0.1M二甲胂酸盐缓冲液中孵育3次，每次5分钟，在冰上。
在使用之前，通过将3％的铁氰化钾在0.2M二甲砷酸盐缓冲液和等体积的4％四氧化锇水溶液中混合，制备新鲜的OsO 4 - 亚铁氰化物缓冲液。将组织块在该溶液中在冰上孵育1小时。
在1小时温育期间，新鲜制备新鲜硫代卡巴酰肼溶液。将0.1g硫代卡巴酰肼（TCH）加入10ml ddH 2 O中，并在60℃烘箱中放置1小时。通过每10分钟轻轻摇动缓冲液以促进溶解。在使用前通过0.22μm微孔注射器过滤器过滤该溶液。
在0.2ml OsO 4 - 亚铁氰化物中温育结束时，将组织在室温下在ddH 2 O中孵育3次，每次5分钟。
去除样品管中的ddH 2 O并在60℃下孵育后直接将TCH加入样品管中。将组织块在室温下在TCH中孵育20分钟。
将组织块在1ml ddH 2 O中孵育3次，每次5分钟，然后在室温下在新制备的0.2ml 2％四氧化锇中温育30分钟。
将组织块在1ml ddH 2 O中孵育3次，每次5分钟，然后在4℃下在1％乙酸双氧铀中温育过夜。
第二天，新鲜制备天冬氨酸溶液。首先，制备0.03M天冬氨酸缓冲液。简言之，在50ml ddH 2 O中加入0.2g L-天冬氨酸。将pH值调节至5.5，然后将天冬氨酸溶液置于60℃直至天冬氨酸完全溶解。其次，制备天冬氨酸铅溶液。将0.066g硝酸铅溶于10ml天冬氨酸溶液中。将铅溶液在60℃的烤箱中30分钟。
将组织块在1ml ddH 2 O中孵育3次，每次5分钟，然后在60℃的铅溶液中温育30分钟。
将组织块在室温下在1ml ddH 2 O中孵育3次，每次5分钟，然后使用新鲜制备的20％，60％，80％，90％，100％ 100％乙醇，每步5分钟。
将组织块在丙酮中在室温下温育10分钟。
在丙酮孵育期间，使用Epon-812包埋试剂盒制备100％Epon溶液，如下：将EMbed-812 10ml，十二碳烯基琥珀酸酐（DDSA）8ml，甲基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酐4 2，2-二甲氧基丙烷（DMP-30）0.4ml一起很好。为了制备50％Epon溶液，将等体积的100％Epon与100％丙酮混合
将组织块在50％Epon溶液中在室温下温育2小时。
将组织块在室温下置于摇床上的100％Epon溶液中过夜
第二天早上，使用配方在17中准备新的100％Epon溶液。将组织转移到新的Epon溶液中，然后在室温下在振荡器上放置2小时。
转移Epon到塑料扁平嵌入模具，并在60℃烘箱中聚合组织块过夜
切割从Epon块中取出的样本，并尝试删除样本周围的所有Epon 注意：最好切割所有的Epon，因为Epon将导致在扫描期间充电。切割后组织块的最佳尺寸为1 * 1 * 2 mm ³ ，但这是非常技术要求，人们很少达到标准。
使用具有Gatan 3视图的Zeiss Sigma VP SEM获得SBF-SEM图像。通过以8192×8192像素的分辨率切割（48×48×20）μm<3>组织块（长度×宽度×深度）获得100nm步长的图像的连续图像堆叠。
注意：步骤1-20应在通风橱下进行。

代表数据

图2.来自显示小胶质细胞中的核和线粒体的堆叠图像的代表性单SBF-SEM图像。 ↑：Mitochondria; ★：核。

第二部分。 3D-EM图像中的核和线粒体的定量

软件

斐济软件（NIH; http://fiji.sc/Downloads ）

程序

将同一堆叠的图像保存在一个文件夹中。
打开斐济软件并将文件夹拖动到斐济软件以打开图像。
单击插件/注册/线性堆栈与SIFT对齐以生成对齐的堆栈图像。
将堆栈图像保存为tiff格式。
单击文件/新建/TrakEM2（空白），然后选择存储TrakEM文件的位置。
将tiff格式的对齐堆叠图像拖动到TrakEM图像处理站。
在模板窗口中，右键单击任何/添加新的子/区列表
在"项目对象"窗口中，右键单击"未命名/添加/新建任何内容"
在项目对象窗口中，右键单击任何/添加/新建区域列表。
右键单击新建area_list /重命名以将图层重命名为核。
在项目对象窗口中，右键单击任何/添加/新建区域列表。
右键单击新建area_list /重命名将该层重命名为线粒体。
在图像处理站中，右键单击堆叠图像，选择显示/校准，将长度单位更改为微米，并将像素宽度，像素高度和体素深度放在窗口中。像素宽度和像素高度应根据图像扫描设置计算。体素深度是堆叠中每个图像的间隔。例如，如果图像的间隔为100nm，则体素深度应为0.1微米
在"图层"窗口中，选择所有图层，然后右键单击图层，选择"缩放Z"和"厚度"，计算缩放数，应放在绕线器中，并使每个图层的间隔等于体素深度。
在图像处理站中，窗口左侧应出现两层命名为核和线粒体
点击核心层，双击滴管工具选择一种颜色。
使用笔工具绘制在堆栈的每个图像中的核的轮廓，并单击shift + F填充每个图像中的核区域，以使核的3D重建
在斐济的控制惩罚中，单击分析/测量以测量核的参数，包括体积
核形状的量化在3D重建中进行。核被分类如下;圆形：圆形和光滑表面，长/宽比≤1.5;细长的：长/宽> 1.5的细长或椭圆形，并且可具有小的凹痕;生叶：具有单个中间大缺口的两个连接的叶;不规则：具有波纹表面的复杂形状，并且可以具有多个和可变的大小凹痕。
点击线粒体层，双击滴管工具选择除核以外的一种颜色。
使用笔工具绘制线框内的每个图像的线粒体的轮廓，并单击shift + F填充轮廓在每个图像，以使线粒体的三维重建
在斐济的控制面板中，单击分析/测量以测量线粒体的参数，包括体积和最大直径（线粒体的长度）。
通过所有的堆栈图像，选择五个不同的图像，其中线粒体的横截面积可以代表横截面面积的中值。
在五个代表图像中，使用线工具和控制面板中的分析/测量来绘制和测量轴和b轴的长度。
使用横截面积=πab。将所有参数保存在excel文件中。通过以下公式计算平均横截面积：五个横截面积/5的总和。
重复步骤11-12为第二个线粒体添加另一层。
重复步骤20-25做线粒体的定量。
重复步骤26-27，直到完成细胞中所有线粒体的定量。
计算细胞中线粒体的数量和线粒体的总体积

致谢

作者要感谢Richard M. Ransohoff博士实验室的成员对这份手稿的帮助。这项工作由国家多发性硬化症协会支持。

参考文献

TrackEM2用户手册： http://www.ini.uzh.ch/~acardona/trakem2_manual .html
TrakEM2教程： http://fiji.sc/TrakEM2_tutorials