材料和试剂

目标二元质粒与相邻的限制酶切割位点靠近右边界或纯化质粒共同轰击注意：有许多可用的二元载体，任何可以使用的，只要载体含有必要的限制酶切割位点，以移动pWY82的端粒片段。 pWY82的地图和序列可以通过联系相应的作者获得。另外，建议将端粒序列置于右边界附近，如原始截短质粒（Yu等，2007）。将其放在左边框内是不是有效的。
质粒pWY82（联系对应作者）
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27104）
Ambion ^TM无核酸酶水（未经DEPC处理）（Fisher Scientific，目录号：AM9937）
限制酶（New England Biolabs）
注意：酶必须基于pWY82和靶向量之间的兼容性来选择。
UltraPure ^TM低熔点琼脂糖（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：16520-050）}
Trizma ^{®（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）}
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：27225）
南极磷酸酶（New England BioLabs，目录号：M0289S）
DNA凝胶加载染料（6x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0611）
GeneRuler 1 kb DNA梯（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0311）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E7637）
T4 DNA连接酶（New England BioLabs，目录号：M0202S）
ElectroMAX Stbl4细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：11635-018）
S.O.C Media（具有Catabolic阻遏物的超级最佳肉汤）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15544-034）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
培养皿
DNA聚合酶（新英格兰BioLabs，目录号：M0323S）的Taq
Fisher BioReagents LB Broth，Miller（Granulated）（Fisher Scientific，目录号：BP9723-2）
倍他霉素二盐酸盐五水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S4014）
2x YT培养基（Sigma-Aldrich，目录号：Y2377）
LB肉汤（见食谱）
LB板（参见食谱）
2x YT肉汤（见食谱）
壮观霉素（见食谱）
TAE（见食谱）

设备

30℃培养箱
30°C振动筛
4°C冷室
250ml带挡板的培养瓶
Nanodrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
真空浓缩机
凝胶电泳系统
37°C水浴
70°C水浴
紫外透射仪
电动机
热循环器
向导^® SV凝胶和PCR清洁系统（Promega Corporation，目录号：A9281）

程序

凝胶内结扎
1. 用含有质粒pWY82的含有100mg/ml壮观霉素的LB平板条纹，并在30℃下生长2天。
2. 在2XYT中用单个菌落的pWY82开始3ml起始培养物培养基中加入100毫克/毫升壮观霉素，在30℃和250℃下生长48小时 rpm。
  注意：pWY82是缓慢生长的质粒。
3. 加入500μl 起始培养至125ml 2XYT的带挡板的培养瓶中。摇动250 在30℃下转速48小时，直到用a测量时，OD 600为〜2 分光光度计。
4. 用QIAprep Spin提取质粒DNA Miniprep试剂盒，使用4毫升的每个纺丝柱的培养。用50μl洗脱的核酸酶自由水预热至50°C。
5. 泳池小型进入将1.7ml管放入真空浓缩器中直到的当用Nanodrop测量时，浓度约为1μg/μl 分光光度计。
6. 确认pWY82的完整性，目标质粒和切割位点，通过消化1μgpWY82和靶质粒每个酶单独和串联在制造商之后说明。
  注意：由于端粒重复的不稳定性，当进行琼脂糖时，端粒片段将显示多个条带凝胶电泳与完整的2.6 kb重复不总是可见（图1）。
  
  图1. 1％（w/v）琼脂糖凝胶三种不同 pWY82的菌落用Eco Eco RI切割，并且显示范围为端粒大小
7. 将10μgpWY82和5μg靶标质粒用10个单位的限制酶消化至少1小时。
  注意：总限制性消化量不应超过50μl。
8. 倒入1℃（w/v）低温琼脂糖凝胶，用1×TAE在4℃的冷室中制备。
  注意：使用足够大的梳子将每个限制性消化装置完全装入单个孔中。
9. 用5单位的南极磷酸酶处理目标质粒15分钟 37°C。
10. 在每个反应中加入15μl6x负载染料。
11. 在电泳室中加入1×TAE并小心地灌注插入凝胶。
  注意：低熔点凝胶非常脆弱。
12. 将每个限制性消化内容物完全装入凝胶。
13. 在每个限制性消化道旁边加载6μlGeneRuler 1 kb DNA梯子。
14. 在4℃的冷室中以100V的速度运行凝胶，直到加载染料的下段已经到达了凝胶的底部。
15. 小心地将凝胶转移到含有1 TAE和0.5μg/ml溴化乙锭的培养皿中并染色30分钟。
16. 用紫外光可视化DNA，并通过与参考DNA梯相比估计浓度。
  注意：通过比较样品UV强度来估计浓度梯子紫外线强度。存在于梯子中的DNA的量是在文献中可用。
17. 仔细地消除最高的可见端粒带和目标质粒骨架与手术刀和放入分开的1.7ml管中（图2）。
  
  图2.示例凝胶用于连接。 pNG4是此的靶标质粒结扎。切除盒装部分。
18. 加入1毫升无核酸酶的水凝胶切片，并在4℃下透析过夜，以从琼脂糖中除去盐。
19. 从管中取出水并置于70°C水浴中直到完全熔化（约5分钟）。
  注意：每分钟一次，以确保琼脂糖完全融化。
20. 一旦熔化，将管移至37°C水浴。
21. 在琼脂糖冷却下，将连接酶混合物在单独的1.7ml管中制备（表1）。
  
  表1.连接反应组分
  
  组件
  金额
  
  连接酶缓冲液
  5μl
  
  T4 DNA连接酶
  1μl（400单位）
  
  目标质粒骨架
  从凝胶估算出100ng
  
  端粒
  至50μl
22. 冷却约5分钟后，加入目标质粒和端粒进行连接混合物。
  注意：快速工作，琼脂糖不会在移液器尖端固化。
23. 通过温和的移液混合并使其恢复到室温。
  注意：反应应该在冷却时固化。
24. 在室温下孵育过夜。
25. 通过加入1ml水至管中进行透析反应，并在室温孵育温度15分钟。
  注意：弹簧管直到琼脂糖自由漂浮在水中。
26. 开始在冰上解冻Stbl4细胞。
  注意：每次反应需要40μl的细胞。
27. 彻底清除透析水，加入50μl新鲜水核酸酶免费水。将管置于70°C水浴中10分钟，或直到完全融化。
  注意：每分钟轻轻甩管，以确保凝胶完全融化了。
28. 向40μlStbl4细胞中加入2μl连接反应以下电击厂商推荐设置为电穿孔机将电穿孔细胞重悬于500毫升S.O.C培养基中并在30ml培养管中以250rpm在30℃摇动1.5小时。
29. 将100μl转化制备物置于预热的LB上含有适当抗生素的板，并在30℃下孵育直至殖民地出现
  注意：由于温度较低，菌落可能需要2天时间出现在盘子上。
30. 筛选具有菌落PCR或菌落杂交的阳性菌落。
  注意：筛选阳性菌落：
  由于端粒的重复性质，不可取通过在端粒插入位点扩增筛选菌落，as 大多数PCR反应将失败。相反，可以进行菌落PCR 使用正向引物退火5'到插入位点靶质粒和与5'位点退火的反向引物 pWY82中的端粒重复序列也插入到靶质粒中如下图3所示。确保良好的底漆是重要的在进行菌落PCR之前，每个质粒中的功能引物pWY82R 序列5'GTGGGACCCGAGGGAATC 3'已被常规用作菌落PCR中的反向引物。
  
  图3.应选择与插入点相邻的菌落PCR引物，不扩增端粒重复
  
  或者，可以筛选整个殖民地的平板通过菌落杂交存在端粒（Sambrook等，1989）。该方法允许立即快速筛选数百个菌落，并且非常敏感。寡核苷酸探针用于杂交由10个单位的端粒重复组成，无论是在 5'或3'方向。最后，建议序列化端粒重复以确保插入物处于正确的方向。
检测端粒插入物大小
一旦获得阳性菌落，筛选菌落的端粒重要是重要的。对于大多数目的，可能需要具有最大端粒插入的菌落进行转化。端粒大小估计最好通过南方转移和杂交（Southern，1975）进行。靶质粒以及质粒pWY82与测试的菌落一起作为对照。
1. 接种阳性菌落，加上一种pWY82和一种培养物的原始目标质粒，加入3ml含有的2XYT培养基适当的抗生素。在30℃下以250rpm摇动培养8小时。
2. 用100μl的起始培养物接种新鲜的5ml 2XYT培养物的每个菌落含有适当的抗生素，并在250℃摇匀在30℃下16-18小时。
  注意：有时有用接种并生长已经存在的较大（25ml）培养物的菌落选择。一个等分试样可用于筛选，当克隆已经被使用时用所需的端粒片段鉴定，剩下的培养物可以然后用于较大规模的质粒制备。
3. 使用4 ml的每种培养物，用QIAprep Spin Miniprep提取质粒DNA 套件将质粒提取到40μl温（55℃）核酸酶中水。
4. 对1μg每个质粒进行限制性消化 20μl总体积使用将切割为接近端粒的酶尽可能插入两端，以切除端粒插入物。另外，用也会切断端粒的酶切割pWY82 插入作参考。
5. 使用足够大的梳子将标准的1％（w/v）1x TAE琼脂糖凝胶倒入以适应整个限制性消化。
6. 限制性消化完成后，向每个反应中加入5μl6x负载染料。
7. 将每个消化物装载到琼脂糖凝胶中，并以100 V运行，直到较低的条带到达凝胶的底部。
8. 小心地将凝胶转移到含有1 TAE和0.5μg/ml溴化乙锭的培养皿中并染色30分钟。
9. 用紫外线可视化DNA。
  注意：由于端粒的二级结构，来自限制性摘要的端粒大小的估计将是不可靠的。
10. 通过Southern转移将DNA转移到硝酸纤维素膜上（Green和Sambrook，2012）。
11. 将膜与放射性标记的寡核苷酸杂交与尺寸标准相比较来估计端粒尺寸（绿色和 Sambrook，2012）。
  注意：序列寡核苷酸（TTTAGGG）<10>对于检测端粒的存在是非常敏感的。

端粒PCR方法生成端粒片段
可以使用PCR产生不同大小的端粒片段，以用于微染色体生产的共轰击方法。使用如下所示的引物，如图所示进行反应，将产生不同大小的各种端粒聚集体，可通过引物交叉退火产生。这些端粒长度可以通过凝胶电泳显现。可以通过从琼脂糖凝胶中切出所需的端粒尺寸来获得特定长度的端粒DNA。以下步骤将概述如何通过PCR产生端粒片段以及如何利用所获得的DNA。该协议改编自用于制备标记端粒的荧光探针的类似方案（IJdo等人，1991）。

开发PCR引物

使用下面的序列进行引物开发。这些将允许生产大型端粒碎片。
端粒引物：5'（TTTAGGG）10 3'。
端粒引物反义：5'（CCCTAAA）10 3'
引物可以稀释到上面列出的微摩尔浓度下表列出了不同端粒片段的大小

1.25微摩尔前向端粒引物 1.25微摩尔的反向端粒引物	产生更大的片段（见图4）
25微米前向端粒引物 25微米的反向端粒引物	产生较短片段（见图4）

PCR反应组装

使用校对Taq聚合酶，如LongAmp Taq DNA 来自New England Biolabs的聚合酶，并使用上述浓度引物。建议至少进行四次反应以获得在DNA凝胶提取后使用足够的DNA。 PCR反应装置为如下：
使用来自NEB的LongAmp Taq 聚合酶的PCR反应装置

核酸酶自由水	12微升	24微升
5x LongAmp 缓冲区	4微升	8微升
感觉端粒底漆	0.5微升	1微升
反义端粒底漆	0.5微升	1微升
10mM dNTPs	2微升	4微升
LongAmp 聚合酶	1微升	2微升
	每次反应20微升	每次反应40微升

热循环仪协议

98°C 10秒 55°C 20秒 72°C 5秒	重复5x
98°C 20秒 55°C 20秒 72°C 5秒	重复5x
98°C 20秒 55°C 20秒 72°C 10秒	重复5x
98°C 20秒 62°C 20秒 72°C 30秒	重复5x
72°C 5分钟
4°C∞

注意：建议使用大容量PCR反应或者准备几个PCR反应以增加量端粒DNA可供使用。

使用凝胶电泳来确定产生的片段的大小（图4）。
注意：
1. 图4中凝胶图像上染色的DNA的涂片是端粒不同大小的碎片。图4是40微升PCR的结果反应。切出与所需尺寸相关的涂片由梯子指示提供该长度的端粒片段。
2. 图4中端粒片段的涂片基于大小不同使用Taq聚合酶以及引物浓度。
  
  图凝胶电泳后成像的端粒PCR产物实例：L 表示用于该实验的1kb梯形图。 1.25微米和 25微米表示各自存在的PCR引物的浓度样品。
3. 按照凝胶电泳方案（Sambrook和Russell，2001）。
凝胶提取端粒DNA
1. 消除与端粒尺寸对应的凝胶片所需的，并从该凝胶片中提取端粒DNA。例如，如果需要2 kb端粒片段，切出最接近的凝胶涂片关系到梯子上的2 kb标记。一般来说，较大的片段如果目标是截断染色体，则需要端粒，因为端粒片段越大，插入的机会越大端粒片段将被端粒封端所识别机器作为染色体的新端。最小尺寸该识别所需的端粒片段可能因物种而异物种（Teo等人，2011）。
2. 使用向导SV凝胶和PCR 用于从琼脂糖凝胶提取DNA的净化系统。跟着制造商从琼脂糖凝胶中提取DNA的说明书片。
  注意：
  1. 大量的DNA会丢失当进行凝胶提取时。建议使用大容量 PCR反应或多重反应。
  2. 建议使用无核酸酶的水，例如Nuclease-Free进行洗脱来自Life Technologies的水，以便进一步使用克隆
使用提取的DNA
1. 所得到的端粒DNA片段可用于与转基因的配对。
2. （Kikkert等人，2005）中所述的端粒DNA的制备可用于共轰击。

讨论
在概念上，微染色体可以通过自下而上或自上而下的策略来创建。自下而上的策略将需要人造创建着丝粒，端粒和起始复制序列以创建可行的染色体。目前，复制起始点和着丝粒不能在大多数真核生物中人工制造。自上而下的方法利用现有染色体通过用含有端粒的构建体截断来形成微染色体。端粒介导的截短是产生自上而下的微染色体的有效手段。端粒介导的截短（端粒序列）的重要因素可能难以操作，因为它们的构成是大量的重复序列。这里描述的端粒DNA的创建和使用方法是最有效的。将端粒克隆到载体中后，或者制备端粒用于核苷酸序列，通过转化方案正常进行。组织再生与标准转化相同。截短事件的选择可以使用细胞学技术进行，例如原位杂交（Yu et al。，2007）。这些方法应允许产生所需大小的端粒DNA，如果需要，将其包含入载体中，引入选择的种类中，并选择截短的染色体。

食谱

LB肉汤
LB肉汤
对于500ml培养基，将12.5g LB培养基溶于400ml水中将最终体积加至500ml并高压灭菌20分钟
LB板
对于500ml培养基，将12.5g LB培养基和6g琼脂溶于400ml水中将最终体积调至500ml，高压灭菌20分钟允许冷却至50°C并添加适当的抗生素
轻轻旋转，并向培养皿添加薄层
允许冷却，然后倒置并储存在4°C
2x YT肉汤
对于500ml培养基，将15.5g 2x YT粉末溶于400ml水中将最终体积加至500ml并高压灭菌20分钟
壮观霉素（100mg/ml）
对于10ml储存液，将1μg壮观霉素加入到10ml锥形管中的10毫升高压灭菌水中，倒置至完全溶解并用0.2微米过滤器过滤消毒将等分试样500μl放入1.7 ml管中，储存于-20°C
TAE
为了使1L 50x TAE储备液加入242g三唑基，14.6g乙二胺四乙酸（EDTA）和57.1ml乙酸至500ml水中并溶解
将总体积达到1升，用水
稀释至1x工作油与水

致谢

对该主题的研究得到了植物基因组计划国家科学基金会授权IOS-1339198的支持。

参考文献

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