材料和试剂

Heterodera schachtii
Albatros的种子。
拟南芥种子
次氯酸钙
HgCl <2>
吐温20
70％乙醇
GAMBORG B5维生素混合物（Duchefa Biochemie，目录号：G0415）
Daichin琼脂（Duchefa Biochemie，目录号：D1004）
蔗糖
KNO ₃
MgSO 4。。 O
Ca（NO 3）2 sub 2 4H 2 O
KH ₂ PO ₄
FeNaEDTA
H ₃ BO ₃
MnCl 2或MnCl 2 sub。 4H 2 O
CuSO 4或者CuSO 4或者CuSO 4或者CuSO 4，或者CuSO 4和/ O
ZnSO 4 。 7H O
CoCl <2> ^。 6H <2> O
H sub 2 MoO 4或NaMoO 4 sub 。 2H O
NaCl
ZnCl 2
GELRITE ^TM（Duchefa Biochemie，目录号：G1101）
塑料培养皿9厘米
塑料培养皿14.5厘米
铝箔
PVC膜100μm筛（Buddeberg GmbH，目录号：9068289）
PVC膜15μm网目（Buddeberg GmbH，目录号：9068280）
50ml注射器
移液器
水琼脂板的制备（参见配方）
Knop培养基的制备（参见配方）

设备

Nescofilm（或Parafilm）
生长室在25℃下用16小时光/8小时黑暗
实验室玻璃器皿
余额
立体显微镜
带有相机的反显微镜
清洁长椅
高压灭菌器能够达到120°C
带集成摄像头的Axiovert 200M反相显微镜（ZEISS）（ZEISS，型号：AxioCam MRc5）
孵化漏斗（图1）

软件

AxioVision软件（ZEISS）的轮廓工具
SPSS 12.0（SPSS Inc.）

程序

拟南芥和芥菜种子灭菌：
1. 在5％次氯酸钙和0.1％吐温20中浸泡种子10分钟，摇动几次。
2. 倒出溶液，加入70％乙醇，孵育5分钟
3. 在无菌水中洗3次。
4. 在无菌培养皿中的干净的工作台中干燥种子。
H的储存培养物。 schachtii ：
1. 准备14.5厘米0.7％的琼脂平板
2. 准备14.5厘米Knop琼脂平板
3. 将20个无菌芥菜种子放在0.7％的琼脂平板上
4. 用Nescofilm密封板。
5. 在室温避光存放3-4天。
6. 将3株幼苗转移到14.5cm的Knop琼脂平板上，并用Nescofilm密封平板
7. 储存在暗处，室温下约10天。
8. 用线虫感染根（每根根3-4滴）; 使用从感染测试中遗留下来的J2是很方便的
9. 保持板在黑暗的地方在室温，直到囊肿需要。它需要大约2个月，直到囊肿可以收获。它可以存储板最多1年。然而，如果板中的琼脂变得太干，则可能更难挑出囊肿。
制备H。 schachtii 接种物：
1. 准备渠道：
2. 如图1所示，用100μm的筛子组装漏斗。
  
  图1.孵化的漏斗。玻璃烧杯，漏斗，硅胶管和夹子可以从当地供应商处购买
3. 用铝箔覆盖漏斗。
4. 在120℃下高压灭菌20分钟灭菌。
5. 准备15μm和100μm筛（图2）。
  
  图2.需要15μm和100μm筛网用于J2s的灭菌。在此图片上仅显示100μm筛。
6. 从50毫升注射器切下1厘米的高环
7. 加热环的一侧并将其粘合到一块PVC膜（15μm或100μm网）上
8. 在120℃下高压灭菌20分钟灭菌。
9. 制备0.7％gelrite：将1.4g gelrite加入到200ml蒸馏水中，煮至溶液变澄清
10. 在120℃下高压灭菌20分钟。
11. 将5ml倒入15ml管中（在RT下变成固体）
12. 在芥末上从储存培养物中挑选孢囊。
13. 将囊肿放入放置在50ml玻璃烧杯中的100μm筛中
14. 用5％次氯酸钙和0.1％吐温20浸泡囊肿10分钟
15. 用无菌蒸馏水洗涤4次
16. 将带有孢囊的筛子放入孵化漏斗（图1）。
17. 向漏斗中加入3mM ZnCl 2（刺激J2的孵化）。
18. 将孵化漏斗置于室温黑暗中。
19. 孵出的幼虫通过100μm筛进入硅树脂管，并且可以通过简单地从硅胶管（图1）收集 3-5天后打开夹子进入15μm筛子
20. 通过将具有J2的15μm筛子放入含有0.05％HgCl 2的烧杯中消毒J2 2分钟。
21. 通过将带有J2的15μm筛子转移到装有无菌蒸馏水的烧杯中洗涤四次
22. 在接种前将J2重悬于0.7％的gelrite中
23. 调节接种物的浓度为每滴20 J2 通过计数立体声下的液滴中的J2，使用移液管进行凝胶化显微镜。
24. J2可以在4℃的冰箱中储存2-3天，而不丧失其感染性
拟南芥栽培：
1. 准备9厘米的Knop琼脂平板
2. 种植拟南芥植物：
3. 将无菌种子放在Knop琼脂平板上（图3）。每板使用10粒种子。
  
  图3. 拟南芥种子的模板
4. 在4℃下孵育平板4天，以确保均匀发芽
5. 将板水平放置在生长室中2天
6. 倾斜板大约20度，以便根生长到琼脂和培养皿之间的板的底部。
拟南芥植物的接种：
1. 通过将3只植物与每株植物接种60只J2，接种12-d的拟南芥根在根的不同部分含有J2的凝胶状液滴
2. 在室温下在黑暗中水平孵育过夜。
3. 把板放回光。
线虫感染分析：
在13 dpi时拍摄合胞体与女性线虫的照片。
（我们使用具有集成相机的Axiovert 200M反相显微镜）以14dpi计数雄性和雌性线虫的数目（图4）。

图4.雄性（A），雌性（B）线虫和孢囊（C）
合胞体和囊肿（雌性）的大小测量：
1. 随机选择10个合胞体/囊肿。
2. 概述囊肿和 syncytia [我们使用AxioVision软件的Contour工具和软件将计算大小（图5）]。
  
  图5.大小测量雌性线虫和合胞体 tia 。通过AxioVision软件的轮廓工具计算线虫（蓝色）和合胞体（红色）。显示在转基因中诱导的合胞体线过表达WRKY基因和野生型（Col）[来自Ali等人 al。（2014）]
3. 使用方差分析（ANOVA）（P <0.05）分析结果的显着性（我们使用SPSS 12.0）。
计数线虫：
1. 使用立体显微镜。
2. 翻转板材并使用防水标记用不同的颜色标记男性和女性通过放置一个点除了线虫。
3. 计数男性和女性的点。
4. 计算每行的男性和女性的总数植物或根长度。从这些数据计算男/女比例
5. 如果对照和试验的生长（尺寸）存在差异（突变体，转基因株系）在接种分类时根据图6的培养皿上的线
6. 使用方差分析（ANOVA）（P <0.05）（我们使用SPSS 12.0）分析结果的显着性。
  
  图6. 拟南芥植物的生长类。如果植物存在差异，则对拟南芥品系进行分类生长以调节线虫的数量[来自Jürgensen（2001）]。

笔记

已知与男性线虫相比，更多的雌性线虫可以在最佳营养和环境条件下发育。因此，雌性/雄性比率（F/M）是宿主植物提供的发育条件的有意义的指标（Triantaphyllou，1973）。
发现拟南芥植物在用H感染的无菌条件下的生长。 schachtii最适用于用Daichin琼脂制备的0.2倍浓缩的Knop培养基（Sijmons等人，1992）。其他琼脂类型也可以工作，但必须进行测试
线虫的生长和孵化有季节性变化。在夏季，孵化和感染率明显高于冬季
每个测试应包括一个控制以调整接种物的差异
我们做三个重复，每行40株植物（4个培养皿）。
植物和线虫的生长在无菌条件下。此外，接种物的制备必须在无菌条件下进行

食谱

水琼脂平板的制备
1. 将7g Daichin琼脂和1L蒸馏水混合，并在120℃下高压灭菌20分钟
2. 倒入14.5厘米培养皿

Knop培养基的制备

准备Knop培养基（每升）的以下储备溶液

库存解决方案	化学品	g /升	替代化学。	g /升
库存解决方案	KNO ₃	121.32克
库存解决方案	MgSO 4。。 O	19.71克
库存解决方案II	Ca（NO 3）2 sub 2 4H 2 O	120克
储备解决方案III	KH ₂ PO ₄	27.22克
库存解决方案IV	FeNaEDTA	7.34克
库存解决方案V	H ₃ BO ₃	2,86克
	MnCl 2	1.81克	MnCl 2 ^。 4H O	2.85克
	CuSO 4 ^。 5H sub 2 O	0.073克	CuSO 4 ^。 2H <2> O	0.05 g
	ZnSO 4 。 7H O	0.36克
	CoCl <2> ^。 6H <2> O	0.03 g
	H ₂ MoO ₄	0.052克	NaMoO 4 ^。 2H <2> O	0.0775克
	NaCl	2克

准备1 L，0.2x Knop琼脂

蔗糖	20克
大豆琼脂	8克
B5维生素	1 ml
库存解决方案	2 ml
库存解决方案II	2 ml
库存解决方案III	2 ml
库存解决方案IV	0.4 ml
库存解决方案V	0.2 ml

加入去离子水至1 L
用KOH溶液
调节pH至6.4
在120°C高压灭菌20分钟，并在同一天倒板

致谢

这项工作得到FWF奥地利科学基金拨款P16296-B06，P16897-B06和P21067-B12的支持。

参考文献

Ali，M.A.，Wieczorek，K.，Kreil，D.P。和Bohlmann，H。（2014）。甜菜孢囊线虫 Heterodera schachtii 调节WRKY转录因子的表达syncytia以促进其在拟南芥根中的发育。 9（7）：e102360。
Jürgensen，K（2001）。拟南芥作为新模型植物寄生线虫的宿主。植物J 1：245-254
Triantaphyllou，A.C。（1973）。禾本科植物禾本科植物的生殖和繁殖 ottersoni （Nematoda：Heteroderidae） J Nematol 5（2）：84-87。