材料和试剂

三蒸馏丁醇（VWR International，calalog number：20810.323）
来自细胞壁提取物的果胶级分
注意：
1. 细胞壁提取方案描述于Poséet al。（2013）。
2. 来自细胞壁材料的果胶级分通过顺序获得用CDTA缓冲液，然后用碳酸钠缓冲液萃取溶解富集离子和共价的细胞壁级分如Posé等人，（2013）（参见Recipes）中所述。
3. 两种果胶级分（即一种用CDTA提取和另一种用碳酸钠）进行广泛透析储存，直到需要在-20℃作为水溶液。重要：在为了防止可能的聚集，任何冷冻干燥步骤必须避免。建议将样品等分，以避免冻融连续循环。
碳酸氢铵（FLUKA，目录号：09830）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：09830"。
反式-1,2-二氨基环己烷-N，N，N'N'-四乙酸一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：D 319945）
碳酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2127）
NaBH 4（Sigma-Aldrich，目录号：D452882）
10mM碳酸氢铵缓冲液（pH8）（参见配方）
CDTA缓冲区（参见配方）
碳酸钠缓冲液（见配方）

设备

隔音和温度控制室（图1A-1）
使用配备有电视摄像机的低功率光学显微镜将AFM探针粗略地放置在样品的顶部（图1A-2）。
原子力显微镜（East Coast Scientific Limited，Cambridge，UK）（图1A-3;图2A）。可以使用任何合适分辨率的AFM，但软件和液晶盒的细节会有所不同
在AFM显微镜下的抗振台（图1A-4）
光电二极管放大器（图1A-5）
示波器（图1A-6;图3）
数字控制系统由计算机，DAC（数字模拟转换器）盒，激光驱动器和高压放大器组成。（更多细节参见Morris等人，2010）（图1A-7）
PYREX ^®带橡胶衬垫螺帽的文化管（Thomas Scientific，目录号：9212C21）和特氟隆衬里的盖子
注意：使用1％盐酸溶液将螺旋盖玻璃管酸洗过夜，然后用水冲洗。
用胶带（3M，型号：Magic Tape）切割的云母片（Elektron Technology，Agar Scientific，型号：G250）（视频1）
短尖端种类AFM探针模型接触悬臂（Budget Sensors SiNi，保加利亚）
注意：尖端安装在V形悬臂的边缘，这是用于形貌成像的典型几何形状（图1B）。
尖嘴架和开式液桶（图1-C; Vdeo 2）
基本设备：移液器，涡流，超声波浴，加热块

图1。 A。照片包括AFM室设置的概述。数字标签与设备列表说明一致。 B.位于悬臂的自由端的尖端的方案。 C.尖端保持器（左）和液体电池（右）的细节。

软件

AFM软件（SPM 6.01，ECS，Cambridge，UK）
对于长度测量，使用Paint Shop Pro v5.00软件（ http://web.archive.org/web/19980514080113/http://jasc.com/）

使用Gwyddion软件v2.32
优化图像对比度和3D效果

使用Image J v1.43u软件（ http：//imagej.nih。）离线分析AFM图像。 gov/ij/index.html ）

Gwyddion是免费的开源软件，由GNU（通用公共许可证）提供（ http://gwyddion.net/）

程序

在声学隔离和温度控制室处的第一制备步骤是在AFM扫描期间打开空调和所有AFM设备（PC，监视器，放大器...）以避免背景噪声。在此期间，您可以按照下面所述准备样品。

样品准备
1. 稀释果胶溶液（用CDTA和钠获得的果胶级分碳酸盐缓冲液）纯化至1mg/ml，并在80℃加热30分钟。
2. 在10mM碳酸氢铵中连续稀释至终浓度浓度为1-5μg/ml。所需的音量取决于初始音量考虑到样品的浓度只有3微升将需要AFM。稀释液必须刚刚准备好使用前。可升华的缓冲液用于防止缓冲液的沉积晶体在云母基底上，因为它们不会留下残留的盐蒸发时的晶体
3. 将样品在80℃下加热20分钟浸入超声波浴中10分钟。 ^*（仅适用于碳酸钠分数;对于CDTA级分，两个稀释步骤用纯水进行并省略超声步骤）。此步骤促进分解的细胞壁网络，以实现孤立链的可视化
4. 将云母重塑成最终尺寸，这将适合液体电池，和切割片材在角上插入尖锐的尖端或剥离外胶带（视频1）。总是使用镊子操纵云母和保持它们覆盖，以保护灰尘。
  
  视频1.如何切割云母
5. 吸出3微升的CDTA或碳酸钠果胶样品新鲜切割的云母并在加热阶段在37-40℃干燥20分钟，以促进均匀扩散，减少分子聚集以在成像之前升华缓冲器。
  注意：孵化时间，温度和稀释度必须针对不同的聚合物进行优化，始终记住这些参数必须一致将会彼此比较的样本。
原子力显微镜
1. 将样品插入显微镜的液体细胞（图1C）和注入300微升三蒸馏丁醇的细胞，中途样本逼近序列。使用丁醇作为成像溶剂具有双重目的它消除了毛细管冷凝，但也是一个沉淀剂用于多糖，因此防止解吸多糖。
2. AFM尖端探头安装在尖端上（图1B;视频2），插入显微镜（图1A-3）和大致位于顶部的样品使用配备有电视摄像机的低倍显微镜（图1A-2）。尖端的尖锐度决定分辨力的仪器，因此必须仔细操纵，因为它可以钝或如果与多糖直接接触则被污染衬底。
  
  视频2. 如何在开放存储桶单元上挂载示例
3. 使用四象限将激光和检测器光束对准尖端光电二极管和放大器（图2）。在这种情况下，使用的提示有一个谐振频率和力常数为13 KHz和0.4 N/m，分别。
  1. 对准激光束：激光对准旋钮（用图2B中的红色箭头表示）用于移动激光器 X和Y方向，直到激光光斑位于末端悬臂（图2D）。使用光学显微镜可视化激光光斑和悬臂来检查激光是否对准（图 2C-D）
  2. 将光电探测器对准激光束：一旦激光器对准到悬臂上，使用两个不同的螺钉（表示与图2中的黄色箭头，B）以定位光电二极管，使其捕获反射的激光光斑。一旦它检测到反射的激光光束必须精细调整以定位激光光斑到光电二极管的4个象限上的完全中心位置。如果激光器不能正确地定位在悬臂上不可能用光电二极管检测反射光斑。总数由光电检测器产生的电压示于图中电子组合盒（图2F）。悬臂偏转的水平如图2E所示。这表示之间的电压差光电探测器的顶部和底部。对于接触模式，光电检测器的偏转信号必须接近零
    
    图2。 A.原子力显微镜。 B. AFM旋钮对准激光光束和光电探测器。 C.探头与激光对准。 D.探头与激光未正确对齐。 E.带轴数据的光电探测器放大器。 F。带有SUM数据的光电探测器放大器。
4. 接近样品尖端将尖端巧妙地定位在样品表面上。这一步必须小心地进行，以避免将尖端撞到样品上将钝化或污染尖端并毁坏扫描的图像。这一步是在再现示波器（图3）的支持下完成的悬臂的振动。当尖端远离样品时，振动波将是宽的（图3A）和尖端紧密接近表面波模式将使突然改变表示尖端和样品建立接触（图3B）。调整力以在扫描期间获得良好的分辨率。在现代AFM中越来越多地采用这种方法步骤。
  
  图 3.示波器输出信号，当尖端和样品在远（A）或在正确（B）位置。 C.不同提示位置的计划示波器及其示波器输出信号。（看看这些行的行为在视频3）接近序列期间
  
  视频3. AFM方法的一般概述
5. 一旦一切安装和对齐，建议离开样品和仪器在20℃下1小时以平衡温度和减少扫描期间的背景噪音。
6. 成像以2 Hz的扫描速度扫描。
7. AFM从反馈回路的移动同时获取数据在z轴上以在扫描期间保持恒定的力（形貌模式图像），并且从悬臂偏转（误差信号图像）有关地形的附加信息。地形学（图 4B）和误差信号（图4A）模式图像。
  注意：有关AFM方法的一般概述，请参阅视频3。更多信息关于其他生物样品中的替代扫描模式和AFM 描述在Morris et al。（2010）。
AFM图像分析
1. 高度测量。使用AFM分析特征的高度软件（SPM 6.01，ECS，Cambridge，UK）提供，其适合平面并且重新规格化AFM图像。地形数据是区分真正的分支点和重叠的关键链，其中高度加倍，并且这些容易被视觉化为它们在链条的交叉点处显示为亮点（图 4）。
  
  图4。 A.来自成熟的CDTA果胶的代表性图像草莓果实通过AFM获得的接触模式。分支的果胶链并可以观察到具有新兴链的胶束聚集体图片。 B.高度剖面，显示真实分支点的高度（黑色箭头）的聚合物链（轮廓1）和胶束聚集体（轮廓2），其具有与分离链相同高度的新出现的链（灰色箭头）和核心区域（箭头）处的较高高度。转载来自Poséem et al。（2015），获得Elsevier的许可。
2. 长度测量。使用Paint Shop将图像转换为TIFF文件 Pro v 5.00软件。图像对比度和3D布局通过执行 Gwyddion v 2.32软件。然后，使用离线分析图像 ImageJ v1.43u软件通过绘制的绳子与徒手工具软件。为了确定链长仅为分离的链，定义为不与其他链缠结的单独链，它们足够长，可以完全可视化，并且完全可见在测量区域内。链的总长度，包括分支（如果有的话），定义为轮廓长度
  
  图 5. ImageJ工作流程。 A.首先设置扫描大小的缩放比例（例如： 256像素对应于1000nm）。 B.选择徒手工具，绘制链。 C.单击CTRL + M，新数据窗口将提示数据测量。
3. 长度测量的数据分析。
  的轮廓长度可以由具有频率的直方图表示出现特定长度与分子长度的关系（图6）。因为聚合物是不同分子的混合物分子量，它们是自然多分散的，并且它们表征没有很好地用单个平均值描述。代替， AFM数据的特征在于测量数量平均值（），重量平均（）轮廓长度，以及两个平均聚合物长度（），称为多分散指数（PDI）。（）是算术平均值（a），（）是一个权重平均值（b），用于补偿较高计数的偏差的小链在大的（因为更可能遭遇小链在扫描区域完全可视化），并且PDI为参数定义分布曲线的宽度（Pose 等人，2012）。这个对于完全单分散的聚合物，PDI指数将是一致的，因此该值越高，聚合物分散越多。
  
  中间计算的示例包括在表1中。简而言之，一旦收集到轮廓长度数据，间隔 Range 应为（例如：0-25; 25-50; 50-100 ...），以及每个的频率间隔及其标记类（平均间隔范围值）。然后：
  总计（N）=总数据量
  SUM1 =Σ标记等级x频率
  SUM2 =ΣMark Class x SUM1
  = SUM1/N
  = SUM2/SUM1
  PDI =
  
  表1. AFM轮廓长度分析和中间计算以获得L subN，L sub W和PDI 。
4. 分支模式。当真分支点存在时，可以测量每条分离链的分支点和它们的长度。当使用等当量稀释时，支链的数目每个扫描区域可以用于定义分支的百分比聚合物。聚合物的支化差异链，有无侧链和侧链的数目每个骨架通过卡方检验分析
5. 统计分配。通常频率是一个右偏态分布不适合正态分布，中值（ME）是统计参数用Kruskal-Wallis检验分析样品（Pose等人 2012）。对右偏态分布数据的进一步统计分析（图6A-B）可以在拟合Log正态分布时进行（Pose等人， al。，2012）。因此，如果原始数据（L）被自然变换取对数正态分布，得到数据即可通过方差分析（ANOVA）进行比较。另一个有用的选项样本分析是由Log生成的累积频率曲线正常功能（图6C）。
  
  图6.轮廓长度分布从CDTA（A）和碳酸钠（B）可溶性聚合物。棒代表观察数据，而曲线表示Log正态近似。 CDTA的累积频率（黑线）和通过对数正态函数归一化为（Na，Na）2 CO 在每个轮廓中获得的最大峰。对于CDTA，N = 379和372 分别为Na 2 CO 3和SO 3样品。转载自Posé等人（2012） Elsevier的许可
  
  注意：建议分析每个条件至少三打AFM图像，最小为100 从不同图像的独立链的独立测量获得代表性样品。一旦一切都得到优化，AFM 图像每5分钟做一次。有关AFM的一般概述，请参阅视频3 方法。

食谱

10mM碳酸氢铵缓冲液（pH8）使用灭菌Millipore水过滤器。
推荐使用甲酸（HCOOH）或氢氧化铵（NH 4 OH）调节碳酸氢铵pH 8缓冲液。
CDTA缓冲区
0.05M反式-1,2-二氨基环己烷-N，N，N'，N'-四乙酸在0.05M乙酸钠缓冲液（pH 6;用氢氧化钾KOH调节）存储在RT
碳酸钠缓冲液
含有0.1％NaBH 4的0.1M碳酸钠新鲜加入
存储在RT，但总是在使用前添加NaBH <4>
警告：NaBH ₄ 是有毒，腐蚀性和潮湿的危险。应避免吸入和接触皮肤。

致谢

图4从Pose （2015）转载。图6在来自Elsevier的许可下从Posé等人（2012）重印。这项工作由西班牙教育部长和Feder欧洲基金资助（资助参考：AGL2011-24814）。 IFR的研究得到了BBSRC对研究所的核心资助。

参考文献

Liu，D。和Cheng，F。（2011）。使用原子力显微镜对农产品结构表征的研究进展。 J Sci Food Agric 91（5）：783-788。

Morris，V.J.，Kirby，A.R.and Gunning，A.P。（2010）。原子力显微镜生物学家。第2版。帝国学院出版社，伦敦，ISBN-10：184816467X。

Paniagua，C.，Pose，S.，Morris，V.J.，Kirby，A.R.，Quesada，M.A。和Mercado，J.A。（2014）。水果软化和果胶分解：通过原子力显微镜评估纳米结构果胶修饰的概述。 114（6）：1375-1383。
Posé，S.，Kirby，A.R.，Mercado，J.A.，Morris，V.J.and Quesada，M.A。（2012）。使用AFM在成熟草莓果实中对细胞壁果胶级分的结构表征。 Carb Pol 88：882-890。
Pose，S.，Kirby，A.R.，Paniagua，C.，Waldron，K.W.，Morris，V.J.，Quesada，M.A。和Mercado，J.A。（2015）。草莓果胶在果胶裂解酶或多聚半乳糖醛酸酶沉默果实中的纳米结构表征阐明了它们在软化中的作用。 a> Carbohydr Polym 132：134-145
Pose，S.，Paniagua，C.，Cifuentes，M.，Blanco-Portales，R.，Quesada，M.A。和Mercado，J.A。（2013）。了解多聚半乳糖醛酸酶FaPG1基因沉默对果胶基质拆解的影响，增强组织完整性和硬度成熟的草莓果实。 64（12）：3803-3815。
Zdunek，A.，Koziol，A.，Pieczywek，P.M。和Cybulska，J.（2014）。评估梨果细胞壁中果胶，半纤维素和纤维素的纳米结构不同的质地和坚定度。食物生物技术 7（12）：3525-3535。