材料和试剂

植物组织
（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：c10337）
90ml丙酮（WAKO，目录号：019-00353）
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（例如WAKO，目录号：314-90185）
0.5％Triton X-100的1x PBS溶液
塑料管（PCR管或1.5 ml管）
铝箔
90％丙酮（见配方）
固定福尔马林 - 乙酸 - 酒精（FAA）（参见配方）
10 mM EdU储备溶液（见配方）
10μMEdU溶液（参见配方）
Alexa Fluor ^? 488叠氮化物溶液（参见配方）
Click-iT ^? EdU反应缓冲液（参见配方）
Click-iT ^? EdU缓冲添加剂（参见配方）
反应鸡尾酒（见配方）

设备

显微镜（如尼康，型号：ECLIPSE 80i）
振动器
真空泵
干燥器
Razor
镊子

程序

对于实验，选择健康植物并使用幼苗，解剖叶或叶原基，取决于实验的目的。如果你需要使用较老的（成熟的）叶子，使用剃刀切割叶子以获得小型叶片（图1A）。
孵育组织在装有100-200μl10μMEdU溶液的PCR管中2-3小时[图1B;通常2小时。 Kotogányem et al。（2010）显示用10μMEdU标记2小时对于缓慢生长的培养细胞是足够的]。避免将组织或幼苗彻底浸泡在溶液中，以确保如果植物材料不是水生植物，DNA复制和细胞分裂进行的应力较小（图1B）。
孵育后，通过镊子轻轻地转移组织到1.5毫升填充有1毫升90％丙酮的管中，并在冰上孵育10分钟。
通过镊子轻轻转移组织其他1.5毫升管，并用1毫升1×PBS，用移液器洗涤组织3次。
取出上清液并用FAA固定组织2至3小时（固定的时间取决于植物材料或组织）。使用减压泵从开始减压处理15分钟或短暂离心对于固定是有效的
通过镊子轻轻转移组织其他1.5毫升管，用1毫升0.5％Triton X-100在1×PBS中洗涤组织两次，通过摇动（100-150 rpm）5分钟。
洗涤后，制备反应混合物。（不要在洗涤前准备鸡尾酒，以避免降低鸡尾酒的活性。）
取出上清液，加入反应混合物到管中（一般为50-100μl/管），用移液管充分混匀。
无需任何搅拌孵育反应混合物30分钟，通过用铝箔包裹管保护光。为了提高检测灵敏度，用新鲜的50-100μl/管反应混合物重复步骤8
孵育后，通过镊子轻轻转移组织其他1.5毫升管，并用1毫升1×PBS洗涤组织3次，通过摇动（100-150 rpm）20分钟;通过用铝箔包裹管来保护光。
可以使用荧光显微镜观察EdU信号（图1C;对于使用Alexa Fluor 488叠氮化物的EdU检测，使用具有绿色发射滤光片的458-488nm激发）。如果组织在4℃下在黑暗中储存在1×PBS中，则在检测反应后几周或甚至几个月可以观察到EdU信号。

图1.植物材料浸泡在10μMEdU溶液中并显现水生生物Rorippa aquatica（Brassicaceae）叶中S期细胞中的核。 A.叶和叶光盘。 B.茎尖朝向在10μMEdU溶液中浸泡的叶原基。 C.叶中EdU的DNA标记结果。这个数字是在20倍目标下拍摄的。（A）和（B）中的条= 1cm，（C）中为100μm

代表数据

有关代表性数据，请参阅Ichihashi等人（2014年）和Nakayama等人（2014年）的论文。

笔记

基本上，在室温下执行所有步骤。
在所有步骤中，轻轻地工作以保持叶原基和叶的形状和结构
S期细胞中的核可以通过计数在限定区域中的所有信号容易地定量
该方法适用于各种植物组织以检测S期细胞（例如芽顶端分生组织）中的核。

食谱

90％丙酮（100ml） 90 ml丙酮
10ml H 2 O x/v
FAA（100ml）
10ml甲醛（37-40％） 5ml冰乙酸
50ml乙醇 35ml H 2 O 2 /
10mM EdU储液
为了制备10mM EdU储备溶液，向试剂盒中的组分A中加入2ml DMSO（组分C），并充分混合
储存于-20°C
当按指示储存时，该储备溶液将保持稳定长达1年。
10μMEdU溶液
为了制备10μMEdU溶液，使用H 2 O稀释10mM EdU储液至10μM。
Alexa Fluor ^? 488叠氮化物溶液
为了制备Alexa Fluor ^？ 488叠氮化物的工作溶液，向试剂盒中的组分B中加入70μlDMSO，并混匀
储存于-20°C
当按指示储存时，此溶液将保持稳定最长1年。
Click-iT ^? EdU反应缓冲区
为了制备Click-iT EdU反应缓冲液，将3.6ml H 2 O加到400μl的Click-iT EdU反应缓冲液组分D），并混匀。
储存在4°C
按指示存储时，此1x缓冲区将保持稳定长达6个月
Click-iT ^? EdU缓冲添加剂
为了制备Click-iT EdU缓冲添加剂，将1ml H 2 O加入到200mg Click-iT EdU反应缓冲液添加剂（组分F），并混匀。
储存于-20°C
当按指示储存时，该缓冲添加剂将保持稳定长达1年。

反应液
重要的是按表中列出的顺序添加成分，以确保反应以最佳速率进行。
尽快使用反应鸡尾酒

表1.反应鸡尾酒

反应成分	卷
Click-iT ^? EdU反应缓冲区	227.5微升
CuSO 4（成分E）	10微升
Alexa Fluor ^? 488叠氮化物溶液	0.6μl
Click-iT ^? EdU缓冲添加剂	12.5μl
总计约	250微升

致谢

该方案从Kotogány等人修改。（2010）。我们感谢Rumi Amano女士准备数字。这项研究得到日本科学促进会（JSPS）（KAKENHI Grant号22870031,24247007，24770047和25113002）的Grants-in-Aid和来自促进和互助公司的私人科学研究促进基金日本学校SK和BIO-NEXT项目从冈崎综合生物科学研究所KK和HT和研究奖学金从JSPS到HN。

参考文献

Ichihashi，Y.，Kawade，K.and Tsukaya，H。（2014）。拟南芥叶片和叶柄。在Noguchi，T.，Kawano，S.，Tsukaya，H.，Matsunaga，S.，Sakai，A.，Karahara，I。和Hayashi，Y。（eds。）Atlas of plant cell structure em>。 Springer，194-195。
Kotogany，E.，Dudits，D.，Horvath，G.V。和Ayaydin，F。（2010）。用于检测植物细胞和组织中S期细胞周期进展的快速而稳定的测定法，使用乙炔基脱氧尿苷。植物方法 6（1）：5.
Nakayama，H.，Nakayama，N.，Seiki，S.，Kojima，M.，Sakakibara，H.，Sinha，N.and Kimura，S。（2014）。 KNOX-GA基因模块的调控诱导北美湖水芹中的叶绿素改变。植物细胞 26（12）：4733-4748。