材料和试剂

6至9周龄的雌性小鼠
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（100μg/ml，在水中）（Sigma-Aldrich，目录号：P1524）
层粘连蛋白（1mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：23017-015）}
来自溶组织梭菌的胶原酶（10mg/ml Ca 2+ + Mg 2+游离PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：C-9891）
分散酶II（10mg/ml，在Ca 2+ + Mg 2+游离PBS中）（Roche Diagnostics，目录号：04-942-078-001）
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（PBS中4mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
Leibovitz's L-15 Medium（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11415-064）
Neurobasal -A Medium（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10888-022）
无血清（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：17504-044）的B-27补充（50X）
Percoll（Sigma-Aldrich，目录号：P1644）
Hank's平衡盐溶液（HBSS，钙，镁，无酚红）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：1425092）
15mm玻璃盖玻片（Neuvitro，目录号：GG-15）
巴斯德吸管
Falcon 35mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish，20/Pack，500/Case，Sterile（Corning Incorporated，Falcon ，目录号：351008 ）
60/15mm未处理的TC处理的细菌培养皿，20 /包，500 /箱（Corning Incorporated，Falcon ，目录号：351007）
Falcon ^? 14 ml圆底高清PP试管，刻度，带扣帽，无菌，25 /包，500 /箱（Corning Incorporated，Falcon ，目录号：352059）
14L圆底PP试管，无盖，无菌，125 /包，1000 /箱（Corning Incorporated，Falcon ，目录号：352018）

设备

＃10手术刀刀片（Fine Science Tool，目录号：10010-00）（图1）
标准手术刀柄＃3（Fine Science Tool，目录号：10003-12）（图1）
Spring Scissors-Angled to Side（Fine Science Tool，目录号：15006-09）（图1）
小型剪刀（Fine Science Tool，目录号：14095-11）（图1）
标准模式钳（Fine Science Tool，目录号：11000-12）（图1）
Dumont＃5镊子（Fine Science Tool，目录号：11252-20）（图1）
解剖显微镜
摆动转子（Sorvall仪器，型号：HB-4）
离心机（Sorvall仪器，型号：RC5 plus）

图1.用于小鼠解剖和DRG隔离的解剖工具。 A.标准解剖刀柄＃3; B.弹簧剪刀; C.小弯曲剪刀;标准镊子; E. Dumont＃5镊子

程序

制备DRG神经元培养的盖玻片
1. 在解剖前一天，将1块无菌玻璃盖玻片放入 ?35mm培养皿。盖上250微升的聚-L-赖氨酸（PLL）（100微克/毫升在水中）并在37℃孵育过夜。（组织培养孔可以也在这里使用。）
2. 解剖的日子，吸出PLL 溶液从每个盖玻片和添加250微升无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）在盖玻片上。重复3次。第三次洗涤后，离开PBS溶液在盖玻片上，直到层粘连蛋白溶液在室温下就绪
3. 解冻层粘连蛋白缓慢等分在冰上，并在PBS中稀释至2?5μg/ml。从中移除PBS ?盖玻片并加入200μl稀释的层粘连蛋白到PLL包被的 ?盖玻片
4. 在37℃孵育盖玻片至少2小时，然后铺板细胞注意：其他感兴趣的蛋白质，如BSA，硫酸软骨素蛋白聚糖，Nogo和髓鞘提取物可以添加到层粘连蛋白中解。层粘连蛋白是DRG神经突的大量生长所需的。
背根神经节的解剖和隔离
1. 通过CO 2吸入安乐死6至9周龄的雌性小鼠。刮去背部，用70％乙醇洗涤皮肤（图2A）
  
  图2.小鼠解剖。A.剃刮背部并用皮肤清洗 70％乙醇; B.用手术刀沿背部切开中线切口; C.穿过脊柱的腰部;切开子宫颈端脊髓，并取出到60毫米培养皿
2. 做一个中线切口沿着背部用手术刀并偏转皮肤（图2B）。使用一把小弯曲的剪刀剪腰脊柱（图2C）。举起并举起切开的腰部 ?部分用镊子和切开通过肋骨和骨头沿二侧面。切除附着在侧面的任何附着的结缔组织 ?在脊柱下（图2D）。使用小锋利的剪刀，切 ?颈部末端，并取出至60mm培养皿。小心地去除肋骨，肌肉和结缔组织可能。将清洁的脊柱切成三片（图3A和图3B） ?B）。
3. 在背面之间放一片弹簧剪刀脊柱和椎管，并仔细切穿椎体柱。沿着腹侧重复这个过程，并向右和向左拉脊柱左半部（图3C和D）
4. 放置脊柱片在室温（RT）下进入L15培养基。去除脊柱使用细镊子（＃5 Dumont）。在解剖显微镜下，找到位于沿着外侧椎骨的小腔中的DRG 柱。将＃5镊子的提示放在DRG下面，拔出并将其转移到含有L15培养基的培养皿中。
5. 使用细镊子，去除围绕DRGs和切割的任何纤维结构 ?关闭任何附加的神经根。转移DRGs到15毫升管填充与L15媒体。
  
  图3.脊柱剥离 A.去除肋骨，来自脊柱的肌肉和结缔组织; B.切割清洁脊柱三段; C.穿过脊柱从背侧到腹侧; D.拉开右半边和左半边脊柱。
6. 以200×g离心2分钟。去掉 ?培养基并用1ml L15培养基替换。加入200μl 胶原酶和Dispase II溶液。轻轻混合悬浮液在37℃孵育20分钟
7. 小心地除去酶溶液，加入2ml L15
8. 用火抛光玻璃巴斯德吸管研磨溶液，加入 ?25μlDNaseI，并将细胞悬浮液在37℃下孵育20分钟
9. 再次重复研磨，加入5ml L15
10. 在200×g下旋转细胞5分钟，除去上清液，并将细胞沉淀重悬在5ml的L15中。
11. 重复此步骤一次，并将细胞沉淀重悬在2ml L15培养基中
  
  图4. DRG的隔离。A.解剖的脊柱，箭头和箭头;脊髓; B.脊柱后的脊柱删除。箭头;坐在脊椎上的DRG; C.箭头;孤立 DRG，开口箭头：DRG光纤。
使用Percoll梯度纯化DRG神经元
1. 将1ml 10x Hank's平衡盐溶液（HBSS）加入9ml Percoll中，充分混合，制成90％工作溶液。
2. 在1×HBSS中稀释90％Percoll以制备30和60％Percoll的储备溶液
3. 放置3毫升60％Percoll在14毫升圆底管，小心用3ml的30％Percoll覆盖。重要的是不要打扰界面之间的2个浓度的Percoll。
4. 将1ml的细胞悬液在Percoll梯度溶液中，小心不要打扰Percoll的界面
5. 使用摆动转子在4℃下以800×g离心试管20分钟。
6. 离心后，在两者的界面处有浑浊层 Percoll溶液含有DRG神经元（图5和6）。轻轻地从顶部删除和丢弃第一个3毫升主要包含髓鞘和施万细胞碎片。转移下2毫升含有神经元进入15ml锥形管。
7. 填充15毫升管与L15媒体。以200×g离心10分钟。
8. 除去上清液并将细胞沉淀悬浮在1ml补充有B-27的Neurobasal-A中。
9. 计数单元格编号。我们通常获得大约10,000个可行的DRG神经元 ?从一只鼠标，这是足够的8-10 15毫米圆盖玻片 ?具有用于形态学研究的适当密度，例如神经突长度， ?偏振，等。
  
  图5. Percoll渐变的示例：箭头;施万细胞层;箭头; DRGs层。
  
  图6.通过Percoll梯度分离神经元细胞。 A. 在Percoll梯度之前的细胞悬液的显微镜图像; B. The 从顶层获得的细胞悬液的显微镜图像 Percoll梯度; C.获得的细胞悬液的显微镜图像从中层后Percoll梯度。箭头; DRG神经元;箭头头;施万细胞。
10. 洗涤层粘连蛋白包被的盖玻片与PBS三次。吸出第三次洗涤后，立即在每个盖玻片上加入150μl细胞悬浮液。孵化在37℃培养1小时，然后再加入1ml 在每个35mm培养皿中补充B-27的Neurobasal-A 含有盖玻片。
11. 约24小时后，大量神经突应观察到生长（图7）。持续监控增长。对于 ?神经突生长实验，我们通常在48小时后修复培养电镀。
  
  图7.DRG神经元在体外培养中的代表性图片。来自成年小鼠的解离的DRG神经元在用2μg/ml层粘连蛋白包被的盖玻片。 48小时后，培养物 ?固定并用抗TUJ抗体免疫染色。

致谢

这项工作得到纽约州卫生部脊髓损伤研究委员会的资助。

参考文献

DeBoni，U.and Goldberg，S.S.S.（1989）。使用Percoll梯度从兔或小鼠分离活的背侧神经节神经节的纯级分。在：Shahar，deVellis，Vernadakis和Haber（eds）。神经系统的解剖和组织培养手册。 Alan R Liss，Inc.，230-232。
Lee，S.I.，Zhang，W.，Ravi，M.，Weschenfelder，M.，Bastmeyer，M.and Levine，J.M。非典型蛋白激酶C和Par3是蛋白聚糖诱导的轴突生长抑制所需的。 em> J Neurosci 33（6）：2541-2554。