材料和试剂

一次性手套
无菌一次性无RNase移液器吸头
无RNase微量离心管
植物样品（拟南芥幼芽，第1至9期）
注意：根据Smyth等人，1990年的拟南芥花期。
液氮
GeneJET Plant RNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：K0801）
1 M DTT（Sigma-Aldrich，目录号：43816）
无水乙醇（JT Baker 8006）和96％乙醇（由RNA提取试剂盒制造商推荐，参见上面第6点）
4M LiCl（在蒸馏水中制备并高压灭菌，不一定是新鲜的）
DNase I，无RNA酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0525）
RiboLock核糖核酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：EO0382）
dNTPs各自混合10mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0192）
OligodT-锚定引物（Roche 5'/3'RACE试剂盒）（Roche Diagnostics，目录号：03 353 621 001，版本10）
Maxima Reverse Transcriptase + buffer 5x（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0741）
无RNase水
高保真PCR酶混合物+缓冲液10x（Thermo Fisher Scientific，目录号：K0191）
PCR锚定引物（Roche 5'/3'RACE试剂盒）（Roche Diagnostics，目录号：03 353 621 001）
基因特异性5'引物（表1）
GeneJET凝胶提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：K0691）
Strata Clone PCR Cloning Kit（Agilent Technologies，目录号：240205）
Taq DNA聚合酶（EURx，目录号：EK2500-04）
GeneRuler ^TM 100bp Plus DNA Ladder（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0321）（或为了方便起见，任何其他合适的分子标记）

设备

砂浆和杵（冲洗Haldenwanger砂浆，直径63毫米，清洁，高压灭菌，使用前干燥）
热固机（水浴或加热块也可以使用）（Eppendorf）
微量离心机（Heraeus，Biofuge Pico）
带有转子12,148-H（Sigma-Aldrich）的冷冻离心机BR15（B.Braun Melsungen AG），用于1.5ml Eppendorf管
BioPhotometer Plus（Eppendorf）
热循环仪T100（Bio Rad）（或任何其他常规PCR装置）
电泳系统
紫外透射仪

程序

从花芽中提取总RNA
1. 在砂浆中倒入液氮，让其蒸发，然后仔细放置植物材料。研磨直到细的均匀粉末 ?获得。用小刮刀存放在1.5 ml Eppendorf管中。
  注意：在室温下操作。植物材料可以是新鲜的收集或预先收获并储存在-80℃。在这两种情况下，然而，收获必须在冷冻条件下进行（它是 ?建议保持Eppendorf tub e和铲液体nitr ogen 使用前）。
2. 使用GeneJET Plant RNA纯化试剂盒提取总RNA（参见方案）。
  1. 添加20微升的1 M DTT到每500微升的RNA裂解溶液（含有离液盐的硫氰酸胍）。添加此混合物 ?到含有组织粉末（高达100mg）的管中并涡旋 10-20秒彻底混合。这一步应该快速执行避免退化。
  2. 在56℃下在热混合器或加热块中孵育3分钟
  3. 以最大速度（≥20,000x g，<13,000-14,000 rpm）离心5分钟。
  4. 收集上清液（通常450-550微升），并转移到干净的1.5毫升管
  5. 加入250μl的96％乙醇。通过移液混合。
  6. 将混合物转移到插入2ml收集管（两者随试剂盒提供）中的纯化柱
  7. 以12,000×g（约11,000rpm）离心该柱1分钟。丢弃 ?流通溶液，并重新组装色谱柱和收集管
  8. 向纯化柱中加入700μl洗涤缓冲液WB 1（随试剂盒提供）
  9. 在12,000×g（约11,000rpm）离心1分钟。丢弃流通和收集管。将纯化柱放入清洁2 mL收集管
  10. 向纯化柱中加入500μl洗涤缓冲液2（随试剂盒提供）
  11. 在12,000×g（约11,000rpm）离心1分钟。丢弃流过溶液并重新装配色谱柱和收集管
  12. 重复前面的步骤A2j-k，并以最大速度重新旋转色谱柱1分钟，以清除所有痕量的洗涤缓冲液2.
  13. 用50μl无核酸酶的水洗脱RNA，离心1分钟 ?min，在12,000×g（?11,000rpm）。以相同的音量重复此步骤的无核酸酶水，以提高RNA的产量
  14. 立即使用纯化的RNA或存储直到使用。建议储存在-80°C。
3. DNase处理和浓缩
  1. 用5μl（5 U）DNase I（Thermo Fisher Scientific，根据制造商的方案，略有修改）1小时在37℃消除痕量的基因组DNA。包括RiboLock核糖核酸酶抑制剂1 U /μl，以防止RNA降解
  2. 加入10μl50mM EDTA，并在65℃孵育10分钟
  3. 立即，将RNA样品与两倍体积的冷的100％乙醇混合，并在-20℃下储存数小时或过夜。
  4. 加入1/10体积的4M LiCl，并在12,000rpm和4℃下离心10分钟。小心地清除上清液。
  5. 用500μl冷70％乙醇洗涤，并如步骤A3d离心
  6. 用移液管吸头尽可能多的上清液。放微量离心管与开盖在一个带冰的盒子里，让将颗粒在工作台上或在层流通风室中干燥5分钟注意：在室温下干燥沉淀也很好。
  7. 重悬于25μl无RNA酶的水中，如果不立即使用，存放在-80°C
  8. 通过光度法测定RNA浓度，并通过在2％琼脂糖凝胶中显现500ng来检查完整性（图1）。
    注意：强烈建议使用光度计比色杯和凝胶盘 ?预先用0.4M NaOH处理（至少5分钟）以最小化 ?存在核糖核酸酶。
  9. 对照PCR。尽管DNase I治疗在RNA提取后，将0.5μl样品用作a的模板用脱氧核苷酸引物进行常规PCR反应以测试缺失的基因组DNA。用您选择的一对引物进行PCR 测试样品中DNA的存在。肌动蛋白或其他家务基因可能是合适的 PCR组件：
    16μl蒸馏水
    2.5μl10x缓冲液B（+ 15mM MgCl 2）
    1μldNTPs混合物（各5mM） 1μlACT2-f（5μM）（参见下面的寡核苷酸序列） 1μlACT2-r（5μM）（参见下面的寡核苷酸序列） 0.25μl（1.25U）Taq DNA聚合酶 0.5μlRNA简单
    PCR谱：
    
    1个周期
    94℃，2分钟
    
    35个周期
    94℃，30秒; 51℃，30秒; 72℃，30秒
    
    1个周期
    72℃，10分钟
3'RACE
1. 设计特异性引物（正向引物）设计引物使用免费在线软件OligoCalc （ http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html）。最适合 ?引物长度通常为20至25nt，GC含量为50-60％（as 建议由Roche 5'/3'RACE试剂盒协议）。熔点（Tm）必须接近PCR锚定引物（见下文），而不是超过5°C的差异
2. 重转录。
  根据Maxima Reverse Transcriptase 协议提供的说明进行了微小的修改。
  1. 混合以下组分用于退火反应混合物：
    5μg以前分离的总RNA 将来自Roche 5'/3'RACE试剂盒（A）的1μlOligod（T）-Anchor Primer（37.5μM） polydT延伸，接着是接头序列，参见引物序列下面）
    1μldNTPs混合物（每种10mM）
    14.5μl蒸馏水（不含核酸酶）
  2. 在65℃孵育5分钟。在冰上冷却，离心几个秒（将整个反应置于底部）并置于冰上再次。
  3. 将以下反应组分以指定的顺序
    加入到退火混合物中 4μl5x RT缓冲液（随酶批次提供）
    0.5μl（20 U）RiboLock
    1μl（200 U）Maxima Reverse Transcriptase
  4. 在60℃孵育30分钟。
    注意：富含GC的RNA的反转录可以在65℃进行。实际上，温度可以在50至65℃之间变化。试点实验可能必须找到最佳温度。
  5. 通过在85℃加热5分钟终止反应。
3. 重转帐验证。
  这是一个可选步骤。进行常规PCR程序 ?您选择的一对引物来证实cDNA的存在您的样品。肌动蛋白或其他管家基因可能是合适的
4. 第一PCR（cDNA的PCR扩增）。根据高保真PCR酶混合物协议，有一些修改。
  1. 制备以下反应混合物
    30μl蒸馏水
    5μl10x高保真PCR缓冲液（+ 15mM MgCl 2）
    1μldNTPs混合物，每种10mM
    1μl特异性引物（正向引物），12.5μM
    5μl模板DNA
    0.4μl（2 U）高保真PCR酶混合物
    8μlPCR锚定引物（反向引物）12.5μM（来自Roche 5'/3'RACE Kit，对应于接头序列。参见下面的引物序列）
  2. PCR配置文件（检查制造商的说明，参数可能会根据预期产品的长度而变化）
    1个循环94℃，2分钟
    35个循环94℃C，30秒; 57℃，30秒; 68℃，4分30秒
    1个循环68℃，10分钟
    注意：执行同时反应可能很方便不同的正向引物（2-4）在接近位置按顺序杂交以选择一个产生最佳结果。
  3. 在琼脂糖凝胶（图2）中检查10μl反应物。
    注意：琼脂糖浓度和运行时间可能取决于预期产品的大小。
5. 第二PCR。与步骤B4相同，除了模板（a 第一链PCR）和新的正向引物（杂交下游在第一反应中使用的那一个来支持特异性）
  1. 反应混合物
    34μl蒸馏水
    5μl10x高保真PCR缓冲液（+ 15mM MgCl 2）
    1μldNTPs混合物，每种10mM
    1μl特异性引物（正向引物），12.5μM
    8μlPCR Anchor Primer（反向引物）12.5μM
    1μl第一次PCR反应
    0.4μl（2 U）高保真PCR酶混合物
  2. 使用与步骤B4b相同的PCR谱。
    注意：最终正向引物可能是测试的引物之一第一链反应提供它位于一个下游在该步骤期间使用。
6. 分离PCR产物
  1. 加载在琼脂糖凝胶中进行完全反应，并进行电泳直至 ?频带尽可能分开（图3）。
    注意：琼脂糖浓度可能取决于预期产品的长度。
  2. 在紫外透射仪下，切除PCR DNA条带，并单独储存在Eppendorf管中
  3. 使用GeneJET凝胶提取试剂盒纯化DNA（参见方案）或任何其他等效系统。最后，DNA总共从柱上洗脱体积30μl。
7. 克隆和测序。
  洗脱dsDNA PCR 片段含有允许在任何中容易克隆的3'-A突出端 T-载体质粒系统。例如，请参阅用于StrataClone PCR的协议克隆试剂盒。最后，序列和分析插入物的结构包含在阳性克隆中。

代表数据

表1.本研究中使用的寡核苷酸

名称	Secuence（5' - 3'）	参考资料
寡核苷酸（T）-Anchor Primer	GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTV	罗氏5'/3'RACE试剂盒
PCR锚定引物	GACCACGCGTATCGATGTCGAC Roche	5'/3'RACE套件
ACT2-f	CTCTTAACCGTAAAGCTAACAG	An 等人，1996
ACT2-r	AGTGAGAATCTTCATGAGTGAG	An 等人，1996
AGIa（特异性正向引物）	CGGATCGAGAACACAACGAATCG	Rodríguez-Cazorla等人，2015年
AGIb（特异性正向引物）	GGTTTGCTCAAGAAAGCTTACGAGC	Rodríguez-Cazorla等人，2015年

V = A，C或G

图1.在用溴化乙锭（EtBr）染色的2％琼脂糖凝胶中的总RNA的相对定量和定性分析。泳道1：分子量梯度。泳道2-5：500ng来自不同样品的总RNA

图2.在EtBr染色的琼脂糖凝胶（1％）中第一PCR步骤的验证。泳道1：分子量梯度。泳道2：10μl的第一次PCR反应

图3.在EtBr染色的琼脂糖凝胶（1.5％）中第二PCR步骤的验证。泳道1：分子量梯度。泳道2：总PCR样品（50μl）。可以区分不同大小的四个条带（A至D），如步骤B6b-c所示，可以进行切割和纯化。

图4.由RACE识别的过早处理的 AG 成绩单的示例的示意图。对应于外显子2的DNA序列显示为黑色大写字母。 Intron 2序列显示为小写黑色字母。显示切割位点（A为红色）。另外的代表性数据还可以参考来自Rodríguez-Cazorla等人的图4和S11。（2015）。

致谢

这项工作得到西班牙经济部长奖学金的支持（ https://sede.micinn.gob.es ）（授予BIO2014-56321-P至AV）和美国国家科学基金会（ http：//www。 nsf.gov/;授予IOS-1121055至MFY）和Paul D. Saltman授予科学教育主席（http://biology.ucsd.edu/news/awards-and-honors/endowedchairs.html）至MFY。

参考文献

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Bentley，D.L。（2014）。将mRNA处理与时间和空间中的转录相结合。 Nat Rev Genet 15（3）：163-175。
Nojima，T.，Gomes，T.，Grosso，A.R.，Kimura，H.，Dye，M.J.，Dhir，S.，Carmo-Fonseca，M.and Proudfoot，N.J。哺乳动物NET-Seq揭示了与RNA加工耦合的全基因组新生转录。 C 161（3）：526-540
Rodriguez-Cazorla，E.，Ripoll，J.J.，Andujar，A.，Bailey，L.J.，Martinez-Laborda，A.，Yanofsky，M.F.and Vera，A。（2015）。 K-同源核核糖核蛋白调节拟南芥中的花器官特性和确定性。 PLoS Genet 11（2）：e1004983。
Smyth，D.R.，Bowman，J.L.和Meyerowitz，E.M。（1990）。拟南芥中的早期花卉发育植物Cell 2（8）：755-767。
Yanofsky，M.F.，Ma，H.，Bowman，J.L.，Drews，G.N.，Feldmann，K.A。和Meyerowitz，E.M。由拟南芥同源异型基因agamous编码的蛋白质类似于转录因子。/a> 346（6279）：35-39