材料和试剂

10cm培养皿（SARSTEDT AG& Co，目录号：82.1473）
玻璃巴斯德移液管150mm（VWR International，目录号：612-1701）
转移移液管（SARSTEDT AG& Co，目录号：86.1174）
钨丝（Goodfellow，目录号：w005160）
10ml注射器（HARTMANN USA，Omnifix ，目录号：4617100V）
针20G（Henke Sass Wolf，目录号：4710009040）
新鲜受精鸡蛋（最好来自当地供应商）
L-15培养基（Life Technologies，目录号：11415-049）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11415-049"。
Dispase I（Roche Diagnostics，目录号：04942086001）
&热灭活胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ^TM，目录号：10106-169）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10106-169"。
Dulbecco's改良的Eagle培养基10x（MEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D2429）
氢氧化钠（NaOH）（EMD Millipore Corporation，目录号：1.06469.1000）
胶原（3.1mg/ml）（Pure Col）（Advanced BioMatrix，目录号：5005-B）
碳酸氢钠7.5％（BIC）（Life Technologies，目录号：25080）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：25080" />
DMEM/F-12，GlutaMAX 补充剂（Life Technologies，目录号：31331-028）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：31331-028"
Neurobasal培养基（Life Technologies，目录号：21103-049）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：21103-049" 。
来自牛血清（BSA）的白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
Glutamax（Life Technologies，目录号：35050-038）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：35050-038"
青霉素链霉素（PEST）（Life Technologies，目录号：15140-122）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15140-122"
N2补充剂（Life Technologies，目录号：17502-048）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：17502-048"
B27-补充剂（Life Technologies，目录号：17504-044）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：17504-044"
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
Dispase I解决方案（参见配方）
寝具解决方案（见配方）
生长介质（见配方）

设备

加湿，38℃鸡蛋培养箱（Grumbach，目录号：8012）
加湿，37℃组织培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51030287）
16℃培养箱（Gemini BV Laboratory，Liebherr，目录号：4294 F1-1）
解剖显微镜和光源（ZEISS，型号：Zeiss Stemi SV11和Zeiss KL1500LCD）
硼硅酸盐玻璃毛细管（Harvard Apparatus，目录号：GC100TF-10）
用于IVF（Thermo Fisher Scientific，目录号：144444）的Nunc 4孔培养皿
火焰/棕色微量移液器（SUTTER，目录号：P-97）
针架（Fine science tools，目录号：26016-12）
镊子（精细科学工具，目录号：11252-20）
微型剪刀（Fine science tools，目录号：15000-00）
解剖剪刀（精细科学工具，目录号：14088-10）
用于校准的微毛细管移液管（Sigma-Aldrich，目录号：A5177-5EA）的抽吸器系统/抽吸管组件

程序

隔离雏鸡胚胎
1. 在16℃（长达一周）存储受精卵，直到实验开始。
2. 水平放置鸡蛋，在38℃的加湿室中孵育 ℃，直到它们达到期望的汉堡 - 汉密尔顿（HH）胚胎阶段（Hamburger和Hamilton，1992）。我们已成功使用此协议与胚胎阶段HH10-25的鸡胚。
3. 打个洞鸡蛋的极区，并去除大约5ml的白蛋白（鸡蛋 ?白色），使用10毫升注射器针降低胚胎内 ?蛋。
4. 使用解剖剪刀在蛋顶部切割一个椭圆形窗口。
5. 从鸡蛋中取出胚胎。使用一对镊子握住膜附近的胚胎和解剖剪刀切膜（参见视频1的步骤A3-5）。转移胚胎 ?将膜连接到含有冷L-15的冰上的10cm陪替氏培养皿中中。在进行之前从所有孵育的卵中取出胚胎胚胎解剖
6. 放置含有胚胎的培养皿在解剖显微镜下，去除周围的膜胚胎使用镊子和解剖微剪刀（图1a-b）和使用移液管将其转移到冰上新的冷L-15培养基中
7. 部分阶段的胚胎和保持期望的发育阶段的胚胎（Hamburger和Hamilton，1992）。
"原始"胚胎解剖
注意：从这一点开始，胚胎组织的所有解剖步骤将在解剖显微镜下在室温下进行。
1. 将胚胎在含有冰冷的L-15培养基的培养皿中。有了直钨丝保持胚胎固定和与钩形钨针去除尽可能多的间质而不损害神经管（参见图1b-d）。
2. 切割感兴趣的神经管的区域（例如图1e）钩形针并将神经管件转移到四孔使用玻璃巴斯德吸管在含有L15培养基的冰上平板。
3. 重复步骤B1-2到剩余的胚胎，一个时间。如果合适， ?可以合并到四孔板上的相同孔中。
"精细"胚胎剥离
1. 使用微量吸管拔出硼硅酸盐玻璃毛细管并切割针的技巧用镊子。通常，尖端大约直径为0.5mm允许容易地操作解剖组织（外植体）。
2. 使用四孔板制备Dispase I溶液孔，10％FBS/L-15溶液孔和两个L-15培养基孔（洗涤孔）。使用足以覆盖解剖的溶液体积组织（每孔500μl溶液通常是足够的）。放在室温（RT）。将转移来自步骤B的解剖胚胎 ?玻璃巴斯德吸管顺序通过四个孔与一个在RT下5分钟/孔的孵育期。保持组织在最后洗涤井，并将其放在冰上。不要孵化组织 Dispase I溶液超过5分钟。
3. 外套两个10厘米petri 用?2ml FBS的培养皿并在室温下孵育2分钟。删除FBS和加入冰冷的L-15培养基。将菜肴放在冰上。
4. 转移一个组织 ?并取出剩余的间充质组织使用钨针附着到神经管。用一个直形针以保持组织和钩形针去除剩余的间充质。一旦所有间质被删除组织应该看起来"有光泽"和光滑（见图1f）。使用钩形钨针以切割神经管的期望区域 ?（例如腹侧中线，图1g，中间或背侧） ?神经管的区域）。
5. 转移解剖组织（外植体）与玻璃毛细管（步骤C1中制备）在口中混合吸气管到涂有FBS并含有L-15的四孔板培养基（约600μl）。改变一个新的涂层培养皿后第二次组织解剖，以确保培养皿中的培养基总是冷。
组织孵育
1. 根据配方准备床上用品。
2. 加入16μl 滴到四孔板的孔的底部。孵化在加湿组织培养箱中37℃孵育25-30min，直至气泡变得稍微"乳白色"（图1h，左上井）
3. 加入2滴?50微升垫层溶液到10厘米培养皿的盖子碟。通过用玻璃毛细管将外植体转移来洗涤外植体 ?嘴抽吸管从一滴床上用品到另一个。
4. 加 ??20μl的床上用品溶液在干燥的床上用品从步骤上滴下 D2，并将来自步骤D3的洗涤的外植体转移至新的一滴寝具。外植体将沉到干滴的顶部。位置外植体使用钨针（见图1i）
5. 孵化 ?30-60分钟，在37℃的湿润组织培养箱中培养床上用品下降硬化。加入650μl/孔的生长培养基并在37℃孵育 37℃。可以在任何时间向生长介质中加入可溶性因子根据实验设置。培养外植体的所需根据实验设置的时间段。

代表数据

视频1.从鸡卵中分离雏鸡胚胎

图1.小鸡神经管外植体技术的不同步骤的代表性图像。 a。从鸡蛋隔绝的小鸡胚胎; b。从周围膜分离的鸡胚; C。鸡胚"原始"解剖步骤后; d。钨针保持"原始"解剖胚胎; e。 c中所示的胚胎神经管的解剖的后脑区域; c中的装箱区域对应于e中所示的区域; F。神经管精细解剖后的神经管显示在e。注意，围绕e中的神经管（NT）的间充质（M）现在被完全去除; G。孤立腹侧区神经管，大致对应于f中的方框区; H。在左上孔含有胶原泡的4孔板;一世。包含2个分离的神经管外植体的胶原泡。

食谱

Dispase I溶液
通过将分散酶I溶解在水中至最终浓度为5mg/ml制备储备溶液分装溶液，并在-20°C储存一年。
通过将储备溶液在L-15培养基中稀释至1mg/ml的终浓度来制备Dispase I的工作溶液。
寝具解决方案
注意：此解决方案应该是新鲜准备的。
将8.64μl2.5M NaOH加入到200μlMEM 10x中并涡旋
解决方案将变为粉红色
加入1.8ml胶原（3.1mg/ml）并混合
解决方案将变为杏色
加入88μlBIC并混合
最终溶液应为浅粉红色
将溶液储存在冰上
生长媒介
将250ml的DMEM/F12 + Glutamax培养基与250ml的Neurobasal培养基，2.5ml的Glutamax，2.5ml的N2补充物，5ml的B27-补充剂，1.3ml的10mg/ml的BSA储备液， 5ml PEST和4μl2-巯基乙醇。储存在4°C高达一个月

致谢

这项工作的资金由Cancerfonden和Karolinska Institutet提供。该方案改编自Vallstedt等人（2005）和Dias等人（2014）中公开的程序。

参考文献

Dias，J.M.，Alekseenko，Z.，Applequist，J.M.and Ericson，J.（2014）。 Tgfbeta信号调节中枢神经系统中神经干细胞的时间神经发生和效能。 Neuron 84（5）：927-939。
Hamburger，V。和Hamilton，H.L。（1992）。鸡胚发育的一系列正常阶段。 1951. Dev Dyn 195（4）：231-272
Lek，M.，Dias，JM，Marklund，U.，Uhde，CW，Kurdija，S.，Lei，Q.，Sussel，L.，Rubenstein，JL，Matise，MP，Arnold，HH，Jessell，，J.（2010）。同源异型域反馈电路在腹侧神经图案化过程中支持Shh morphogen梯度的阶梯函数解释。 a> 137（23）：4051-4060。
Vallstedt，A.，Klos，J.M。和Ericson，J。（2005）。脊髓和后脑中少突胶质细胞生成的多个背根源。神经元 45（1）：55-67