材料和试剂

Tygon R-3603管，I.D。 1/16英寸（Saint-Gobain，目录号：AAC00002）
1级定性过滤纸（GE Healthcare，目录号：1001-090）
分生孢子菌
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 PO 4，H 2 O 2）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号码：S369-500）
磷酸氢二钠无水（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S-7907）
蛋白酶抑制剂混合物，完全ULTRA片剂，无EDTA（Roche Diagnostics，目录号：04693132001）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：04693132001"。
玻璃珠（500μm）（Bio Spec Product，目录号：11079105）
在33mM（最终）磷酸盐缓冲液（pH8.2）中的10％（w/v）蔗糖（蒸汽灭菌并在4℃储存直到使用）
在33mM（最终）磷酸盐缓冲液（pH 8.2）中的65％（w/v）蔗糖（蒸汽消毒并在4℃储存直到使用）
D-生物素（Faga Labs，目录号：CAS-58-85-5）
Vogel的完整介质（见配方）
50x盐溶液（见配方）
微量元素溶液（参见配方）
100 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.2）（参见配方）
Laemmli缓冲区（参见配方）

设备

Braun MSK 50ml摇瓶（LABEQUIP LTD，目录号：8541302）
VWR 标准热板搅拌器（VWR International，目录号：12365-382）
快速离心管（Beckman Coulter，目录号：344326）
摇床培养箱（Lab-LineX，型号：Orbit Environ Shaker）
真空过滤系统
Braun MSK细胞匀浆器（LABEQUIP LTD，目录号：953030）
明场显微镜（奥林巴斯，型号：Vanox-S）
Beckman L8-70M超速离心机（在4℃预冷）（Beckman Coulter）
型号70Ti转子（在4℃预冷）（Beckman Coulter）
GM-40线性梯度仪（C. B. S. Scientific）
蠕动（多效）泵（Buchler Lab，目录号：N/A）
管密封器（Beckman Coulter，目录号：342420）
密度梯度分馏器（ISCO，185）
注意：此模型不可用。可以使用带有注射泵的Brandel BR-186梯度分级器。
CIGNET ^TM馏分收集器（ISCO）
注意：此项目也已停用，但可以使用Bio-Rad 2110馏分收集器。
6505W紫外 - 可见分光光度计（Bibby-scientific，Jenway）
折射计（ZEISS，目录号：12230）

程序

匀浆（裂解物）制备
1. 用脉孢菌接种400ml Vogel's完全培养基（Vogel，1956） crassa分生孢子（1×10 6个分生孢子/ml）。孵育14-20小时 ?在30℃，200rpm
2. 通过真空过滤收获菌丝体 Whatman滤纸编号1.用200ml冷无菌洗涤两次蒸馏H 2 O以除去残余培养基，然后用50μL蒸馏两次 ml冷33mM磷酸盐缓冲液（pH 8.2）以平衡菌丝体下一步。
3. 在33℃下混合10g湿菌丝体和10ml 5％（w/v）蔗糖 ?mM磷酸盐缓冲液（pH 8.2），补充有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1片/50ml）装入Braun瓶中，并加入20g玻璃珠（500μm; 2g/g菌丝体）。保持所有的解决方案，管和瓶 ?4℃以防止蛋白质降解。
4. 在博朗均匀化均化器在指向Braun的CO 2流的存在下4×30秒 ?使得均化期间的温度升高防止。 CO <2>线必须牢固地连接到金属臂 Braun均化器，使得CO 2物流可以被引导至瓶子。均质后，通过观察破碎的细胞来验证样品在明视场显微镜。
5. 将匀浆转移到50ml管中（在冰上），并在1,000×g（R av av），10分钟，4℃下离心。
6. 保存上清液在4°C使用玻璃吸管，以避免脂质层。这将是匀浆或裂解物，其将含有线粒体，微泡，核糖体和可溶性蛋白质。丢弃含有全细胞，细胞壁和细胞核的沉淀。
密度梯度离心
1. 构建10-65％蔗糖线性梯度（10％和65％蔗糖储备液溶液必须在最终的33mM磷酸盐缓冲液，pH 8.2中制备） ?快速离心管使用线性梯度仪和a 蠕动泵设置以获得3.5ml/min的流速（图1）。
2. 轻轻地分层 N。 crassa 匀浆（步骤A6中保存的上清液） ?通过使用巴斯德移液管通过在10-65％蔗糖梯度的顶部单滴接近蔗糖梯度的表面。润滑脂离心机入口密封和盖离心管。离心机在预冷却的Beckman转子70Ti中在4℃和4℃下进行4小时。
3. 使用ISCO分馏从顶部分馏梯度系统，使用70％（w/v）蔗糖作为追逐，流速为6ml/min。使 ?确保在进行追踪的管系统中没有形成气泡蔗糖到梯度，否则会破坏它。收集2毫升馏分（3个馏分/分钟）加入到冰冷的管中并保持在4℃
4. 通过测量280nm处的吸光度表征每个级分，折射率（推断密度），理想地，酶活性 ?与细胞内颗粒或囊泡相关（图2A）。折射计输出折射率，可以转换密度（g/ml）： http：//主页。 gac.edu/~cellab/chpts/chpt3/table3-2.html。
5. 混合用Laemmli缓冲液（2x）洗涤50至100μl每种级分，煮沸5分钟并储存在-20℃直到通过Western印迹分析（图2B）
  
  图1.蔗糖密度梯度的制备和分级。 A. ?为了制备密度梯度，蔗糖储备溶液是独立注入梯度制作器的每一列（保持锁定 ?连接一列到另一列的特氟龙阀）。磁性搅拌棒置于10％蔗糖溶液柱中，硅管（清除任何气泡）朝向蠕动泵排出并且通过附接到硅尖端的毛细管引入快速离心管中直到底部。后 ?打开蠕动泵，打开特氟龙阀门以允许蔗糖溶液混合。然后，增加浓度蔗糖流向快速密封管。较低浓度蔗糖首先到达到管，其被更高浓度的蔗糖（毛细管尖总是接触快速密封管底部）。在即将转移蔗糖梯度的总体积之前到快速密封管，关闭蠕动泵并取出非常缓和毛细管，以避免打破梯度。剩下的 ?快速密封管的体积用菌丝体裂解物填充。乙。 ?离心和菌丝体匀浆分离后，使用70％蔗糖溶液将梯度小心分离追。将该溶液注入快速密封管中使得梯度被一体地向上推向出口管和馏分收集器。在分馏之前，它是至关重要的以从包含追加溶液的注射器吹扫任何气泡和将其传导到快速密封管的底部的管道; 否则，梯度可能会断开。收集的馏分是随后表征（酶活性，折射率，吸光度，等）），并在4℃下保存
  
  图2.密度梯度离心匀浆的N。 crassa 表达CHS-6几丁质合酶与GFP共翻译融合（Riquelme等人，2007）。 A。密度（从折射率推测），总蛋白（Abs 280nm） ?和几丁质合酶活性密度梯度收集。几丁质合酶活性沉淀于1.13 g/ml，壳聚糖的浮力密度。 B.蛋白质印迹分析证明了在级分13（1.13g/ml）周围存在CHS-6-GFP。 C.实时成像。 crassa 菌丝通过共聚焦显微镜显示 ?CHS-6-GFP位于尖端主要在Spitzenk?rper的核心（指导菌丝生长的顶端体），其中微泡（壳寡糖）积累，如通过传播所证实的电子显微镜（Riquelme等人，2002）。比例尺，5μm

食谱

Vogel的完整媒介
用蒸馏水稀释50倍盐溶液50倍添加：
蔗糖15g/L
0.5％酵母提取物
0.5％N-Z情况（酪蛋白氨基酸）
蒸汽消毒并在室温下储存

50x盐溶液

Na H 3 H 6 H 6 H 5 O 7 H 6 H 5 O	柠檬酸钠	420 mM
KH ₂ PO ₄	磷酸二氢钾一水合物	1.8 M
NH 4 3	硝酸铵无水	1.2 M
MgSO 4。。 O	硫酸镁七水合物	40.5 mM
CaCl 2 ^。 2H O	氯化钙二水合物	34 mM
微量元素解决方案*		500微升
生物素溶液（0.1mg/ml，在乙醇中）		250微升

用ddH 2 O 2/b达到100ml 加入2ml氯仿作为防腐剂
或者，蒸汽消毒和存储在4°C

微量元素溶液
注意：括号中的浓度是最终浓度。

柠檬酸^。 H sub 2 O	5.0克（238毫摩尔）
ZnSO 4 。 7H O	5.0g（174mM）
Fe（NH 4）2子（SO 4）子部分2子部分。 > 2 O	1.0g（25.5mM）
CuSO 4 ^。 H O	0.25克（14毫摩尔）
MnSO 4 ^。 H sub 2 O	0.05克（2.3毫摩尔）
H BO 3	0.05克（8mM）
Na 2 MoO 4 sub 。 2H 2	0.05克（2.3毫摩尔）

用ddH 2 O 2/b达到100ml 加入1ml氯仿，在室温下贮存

100mM磷酸盐缓冲液（pH8.2）

NaH 2 2 PO 4 4 ^。 H <2> O
1.23克

Na HPO ₄
12.92克

H sub 2 O
最多1 L
Laemmli缓冲区

0.5 M Tris（pH 6.8）
1.25 ml

10％SDS
2.0 ml

甘油
2.5 ml

ddH sub 2 O
9.5 ml

溴酚蓝
1 mg

储存于-20°C
使用前将25μlβ-巯基乙醇加入475μlLaemmli缓冲液中
在Laemmli缓冲液中稀释样品1:2，煮沸4分钟

致谢

这项工作得到墨西哥国家科学技术理事会（CONACYT）授予CB-222375，CB2008-105600-Q和U45818-Q的支持。

参考文献

Fajardo-Somera，R.A.，Bowman，B。和Riquelme，M。（2013）。等离子体膜质子泵PMA-1被纳入到菌丝的远端部分，独立于Spitzenk?rper Eukaryot Cell 12（8）：1097-1105。
Kamada，T.，Bracker，C.E.，Lippman，E。和Bartnicki-García，S。（1991）。在蔗糖密度梯度纯化过程中，内源蛋白酶意外破坏了壳多糖甲壳素合成酶。 p> J Cell Sci 99（Pt 3）：565-570。
Leal-Morales，C.A.，Bracker，C.E.and Bartnicki-García，S。（1988）。几丁质合成酶在酿酒酵母的无细胞匀浆中的定位：壳寡糖和质膜。 Proc Natl Acad Sci USA 85（22）：8516-8520。
Martínez，J.P.，Gimenez，G.，Bracker，C.E.and Bartnicki-García，S。（1989）。来自野生型菌株的壳多糖甲壳素合成酶的沉降性质和的'slime'变体> 。 990（1）：45-52。
Riquelme，M.，Roberson，R.W.，McDaniel，D.P。和Bartnicki-Garcia，S。（2002）。 ropy-1突变对细胞质成熟菌丝的细胞质组织和细胞内运动的影响crassa 。 Fungal Genet Biol 37（2）：171-179。
Riquelme，M.，Bartnicki-García，S.，González-Prieto，J.M.，Sánchez-León，E.，Verdín-Ramos，J.A.，Beltrán-Aguilar，A.and Freitag，M.（2007）。 Spitzenk?rper本地化和绿色荧光蛋白标记的CHS-3和CHS-6几丁质合酶的细胞内流量 6（10）：1853-1864 。
Sánchez-León，E.，Bowman，B.，Seidel，C.，Fischer，R.，Novick，P.and Riquelme，M.（2015）。 Rab GTPase YPT-1与粗糙脉孢菌中的高尔基池和Spitzenk?rper微囊相关联< 。 Mol Microbiol 95（3）：472-490。
Verdín，J.，Bartnicki-García，S。和Riquelme，M。（2009）。粗糙脉孢菌的Spitzenk?rper的功能分层。 < em> Mol Microbiol 74（5）：1044-1053。
Vogel，H.J。（1956）。用于脉孢菌的方便的生长培养基（培养基N）。 Microbiol Genet Bull 13：42-43