材料和试剂

EDTA血液收集管（BD Biosciences，目录号：365873）
1 ml注射器
30号针
微血细胞毛细管毛细管（Thermo Fisher Scientific，目录号：22-362-566）
1ml Eppendorf管（USA Scientific，目录号：1615-5510）
96孔微孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655101）
使用生物工程化肠（移植成熟，然后允许6-8周）移植的8-16周龄的免疫缺陷型NOD-SCID IL-2Rγ裸细胞（NSG）小鼠，
荧光素异硫氰酸酯 - 缀合的葡聚糖（FITC-葡聚糖3-5Kda）（Sigma-Aldrich，目录号：FD4）
无菌水
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
用于吸入麻醉的异氟烷（Henry Schein，目录号：050033）
丁丙诺啡（Midwest Veterinary Supply，目录号：790.06700.3）
异丙醇
吡啶 - 碘
小外科套件（剪刀，环镊子，针驱动器/支架）
3-0 Vicryl缝合线（Ethicon US，目录号：VR416）
GLUture组织粘合剂1.5ml 1/Tb（皮肤闭合胶）（Henry Schein，目录号：034418）

设备

分光光度计（BioTek Instruments，型号：Synergy H1）
解剖立体显微镜（Leica Microsystems）
微量离心机
理发剪/修剪器

程序

将FITC-葡聚糖溶解在无菌水中，最终浓度为20mg/ml
修剪头发在移植的NSG小鼠的腹部，然后用异丙醇和聚乙烯碘清洗皮肤，以创建一个无菌区。
用2％吸入异氟烷通过鼻锥诱导麻醉
一旦小鼠麻醉，用剪刀在移植组织的区域上切割腹部几厘米的皮肤。
使用解剖显微镜将所需的移植肠组织带入并固定到切口区域
将100μl的FITC-葡聚糖溶液倒入装有30号注射针的1ml注射器中
用100μlFITC-Dextran溶液注射移植管腔。
用皮肤胶密封注射部位，以防止溶液渗入腹膜腔。
使用3-0 vicryl缝线以运行方式关闭鼠标的皮肤。
给小鼠皮下注射丁丙诺啡（0.05mg/kg）用于止痛。
从麻醉中取出鼠标，将鼠标放在干净，温暖的地方恢复。
在注射后30分钟，将注射的小鼠返回麻醉机用于吸入异氟烷麻醉。
通过使用肝素化毛细管的眼眶后出血收集EDTA血液收集管中的血液。通过翻转管3-4次混合
将鼠标返回到恢复区域，直到从最初注射起4小时的第二个时间点。
在注射后4小时重复步骤13
牺牲小鼠使用CO 2 2暴露，并确认安乐死的颈椎脱臼，收集组织的组织学在这个时候，如果需要。所有动物安乐死必须根据IACUC指南和机构内批准的动物方案进行
使用微量离心机在4℃下以300rpm离心EDTA管10分钟
从EDTA管中取出血清上清液。
在等量的冷PBS中稀释每个样品
使用在PBS中的FITC-葡聚糖（0,125,250,375,500,750,1000μg/ml）的系列稀释制备标准曲线。
加入100微升稀释的血清到96孔，平底板一式两份。记住包括来自未注射FITC-葡聚糖溶液的小鼠的血清的阴性对照
使用分光光度计（激发：485nm;发射：528nm）测定血清中FITC-葡聚糖的浓度。
绘制数据，使用标准曲线确定样品的浓度（图1）。

代表数据

图1。 a。从在PBS中的FITC-葡聚糖的系列稀释获得的标准曲线。 b。与每只小鼠（n = 7）内的4小时的时间点相比，注射入体内植入物的FITC-葡聚糖在小鼠血清中从30分钟的初始时间点显着增加。图中表示的值表示平均值±标准偏差。 * p <0.05

笔记

该方案可以适用于涉及其他类型的移植组织或甚至适合于动物模型中的天然肠组织的其他实验。任何中空的粘液可以以与本方案中概述的类似的方式注射。我们的方案是口服灌胃FITC-Dextran的替代方案，如先前在Bio-protocol中所述（Gupta等人，2014）。
用于在我们的组织上密封我们的注射部位的皮肤胶提供了足够的密封，以防止FITC-葡聚糖"渗漏"到小鼠的腹膜腔中。注意防止溶液泄漏，这可能影响整体结果。
对腹部缝合闭合的替代方案包括用夹子/U形钉闭合。

致谢

该项目部分由美国国立卫生研究院（NIH）授予NIH-R01DK083325（MAH），NIH P30 DK078392（Digestive Health Center，Cincinnati Children's Hospital Medical Center）和NIH UL1RR026314（临床和转化科学奖（CTSA），University of Cincinnati）。

参考文献

1.Dong，C.X.，Zhao，W.，Solomon，C.，Rowland，K.J.，Ackerley，C.，Robine，S.，Holzenberger，M.，Gonska，T.and Brubaker，肠上皮胰岛素样生长因子-1受体将胰高血糖素样肽-2作用连接到肠屏障功能。 Endocrinology 155（2）：370-379。
Gupta，J。和Nebreda，A.R。（2014）。小鼠肠道通透性分析。生物协议 4（22）：e1289
Watson，CL，Mahe，MM，Munera，J.，Howell，JC，Sundaram，N.，Poling，HM，Schweitzer，JI，Vallance，JE，Mayhew，CN，Sun，Y.，Grabowski，G.，Finkbeiner， SR，Spence，JR，Shroyer，NF，Wells，JM和Helmrath，MA（2014）。使用多能干细胞的人体小肠的体内模型。/a> Nat Med 20（11）：1310-1314。