材料和试剂

TLC硅胶60F 254/20×20cm板（注1）（Merck Millipore Corporation，目录号：1.05715.0001）
滤纸圆（直径15cm）（VWR International，目录号：470204-480）
MilliQ质量水（dH 2 O）
乙腈（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：271004）
乙酸乙酯（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：270989）
（Sigma-Aldrich，目录号：I9516）
N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：222488）
甲醇（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
硫酸（Fluka，目录号：84716）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：84716"。
二甲基亚砜（DMSO）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D128）
α-D-葡萄糖（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：158968）
麦芽糖一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M9171）
麦芽三糖（Sigma-Aldrich，目录号：M8378）
麦芽四糖，DP4（Sigma-Aldrich，目录号：47877）
麦芽五糖（TCI America，目录号：M1023）
麦芽六糖（Sigma-Aldrich，目录号：M9153）
麦芽七糖（Sigma-Aldrich，目录号：284017）
异麦芽糖（Sigma-Aldrich，目录号：I7253）
D-Panose（Sigma-Aldrich，目录号：P2407）
来自牛肝的糖原（Sigma-Aldrich，目录号：G0885）
来自马铃薯淀粉（Sigma-Aldrich，目录号：A8515）的支链淀粉
来自马铃薯的直链淀粉（Sigma-Aldrich，目录号：A0512）
来自 Leuconostoc 的葡聚糖。（Sigma-Aldrich，目录号：31389）
来自洋葱芽孢杆菌的支链淀粉（Sigma-Aldrich，目录号：P4516）
您感兴趣的酶和适当的缓冲液
流动相（参见食谱）
染色溶液（见配方）
低聚糖标准（参见配方）
糖原溶液（见配方）
支链淀粉溶液（参见配方）
直链淀粉溶液（参见配方）
葡聚糖溶液（见配方）

设备

注意：图1中显示了所有需要的设备。

TLC显影室（VWR International，目录号：21432-739）
色谱喷雾器（注2）（Sigma-Aldrich，目录号：Z529729）
能够达到120℃的烘箱（Boekel Scientific，目录号：107905）
或
Milwaukee ^{TM双温度热枪（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：19-313-598）}
Corning ^TM Scholar PC-170热板（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：13-641-564）

图1. 此协议所需的设备

程序

酶反应

准备20倍浓缩的目标酶的溶液和适当的缓冲液。所需酶的浓度将是酶和底物特异性，但是1μg/ml终浓度（20μg/ml储备液）可能是合理的起始位置。
混合90微升待研究的每种底物与5微升浓缩缓冲液和预孵育在所需的温度
加入5μl浓缩酶，通过吸取上下混合，取20μl样品，立即冻结或停止反应。继续在10分钟，20分钟和30分钟取样（注3），冷冻样品，直到您准备好进行TLC。

TLC

加入100ml的流动相到TLC显影室。在流动相中浸泡1或2块滤纸，并将其粘在腔室壁上（见注4）。更换腔室的盖子，并允许流动相与腔室的气氛平衡30分钟
用铅笔从TLC板的底部画2厘米的线，并为每个要装载的样品包括均匀间隔的标记（至少1厘米）。这些可以在铅笔下方的线下标记。
加载1μl的每个标准品和样品。标准可以组合以节省空间，虽然以微小的成本来解决。对于较低浓度的样品，可以使初始点干燥，然后在相同位置加入另外1μl液滴。这可以作为浓缩样品的方法重复进行。
一旦斑点干燥，将TLC板放在显影室中，将板的底部浸入底部的流动相中。流动相的液位不应超过铅笔线。更换腔室上的盖子。
孵育直到流动相到达板的顶部，对于20cm板大约3小时。
为了分离较长的寡糖（>大约12个单糖单元），将板从室中取出，使其干燥，然后将其放回室中以进行第二次上升。

视频1. TLC过程的步骤

染色

使板干燥，然后用染色溶液喷涂板，均匀涂布
让板干燥，然后放在烤箱或使用热风枪在120°C，直到斑点变得清晰可见，约10分钟在烤箱，稍微少一些热风枪。

分析

使用标准来确定所生产产品的身份。注意，对于存在的每个α-1,6键，含有α-1,6键的糖将大约等于所有α-1,4连接的寡糖一个单糖单元更长。例如异麦芽糖，以与麦芽三糖大致相同的距离运行，并且panose以与麦芽四糖相同的距离运行（参见图2）。

代表数据

图2.糖标准。糖标准的运行配置文件示例。麦芽糖通过麦芽糖是从DP2到DP7的葡萄糖的α-1,4连接聚合物。异麦芽糖是与葡萄糖连接的葡萄糖α-1,6，与葡萄糖连接的葡萄糖α-1,6，与麦芽糖连接的葡萄糖α-1,6，葡萄糖麦芽三糖是与麦芽三糖连接的葡萄糖α-1,6。每个标准品为5mM，并将1μl加载到平板上。

笔记

可以使用更小的格式板，特别是如果研究较短的寡糖（麦芽七糖或更小）的生产。
在没有喷雾器的情况下，可以将板浸入染色溶液中，或者可以将染色溶液倒在板上，尽管更可能发生条纹。
该程序设计用于研究初始反应产物。它在一些情况下也是有用的，特别是对于脱支酶（水解α-1,6键），以检查最终反应产物。这可以通过使用更高浓度的酶和/或更长的温育时间来完成，允许反应进行至完成。
浸泡滤纸并将其粘附在室壁上是可选的，但会缩短平衡发生所需的时间。此步骤不会显示在视频1中。
为了储存多糖溶液，通过0.2μm过滤器并加入叠氮化钠至0.02％并在室温下储存（Lichstein和Soule，1944）。对于寡糖溶液，冷冻保存。

食谱

流动相
混合85ml乙腈，20ml乙酸乙酯，50ml 2-丙醇，60ml水
每次测定需要约100 ml（更小的TLC板和小室）
染色溶液
将10ml硫酸加入到190ml甲醇中溶解0.6g N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐
低聚糖标准品
制成5mM水溶液
糖原溶液
将150mg溶于50ml水中
支链淀粉溶液
将150mg溶于3ml DMSO中在剧烈搅拌下缓慢加入热水（60°C以上），使体积达到50ml
直链淀粉溶液
将75mg溶于10ml DMSO中在剧烈搅拌下缓慢加入非常热的水（80°C以上），使体积达到50ml ml
葡聚糖溶液
溶于150毫升水中

致谢

这项工作是由创业基金支持Nicole Koropatkin。 TLC分离方案改编自Robyt和Mukerjea（1994）的工作。

参考文献

Cockburn，D.W.，Orlovsky，N.I.，Foley，M.H.，Kwiatkowski，K.J.，Bahr，C.M.，Maynard，M.，Demeler，B.and Koropatkin，N.M。人类肠道共生菌中的淀粉利用途径的分子细节直肠真实杆菌。 Mol Microbiol 95（2）：209-230。
Hii，S.L.，Tan，J.S.，Ling，T.C.and Ariff，A.B。（2012）。支链淀粉酶：淀粉水解和潜在工业应用中的作用 Enzyme Res 2012：921362.
Lichstein，H.C.and Soule，M.H。（1944）。叠氮钠对微生物生长和呼吸的影响研究：I.叠氮钠对微生物生长。细菌 47（3）：221-230
Robyt，J.F。和Mukerjea，R。（1994）。通过薄层色谱法分离和定量测定纳克量的麦芽糖糊精和异麦芽糖糊精。 Carbohydr Res （251）187-202。