材料和试剂

铝箔
细胞培养板48孔（VWR International，目录号：734-2157）
培养皿（VWR International，目录号：734-2374）
LEW/Ss NHsd雄性大鼠8-10周龄（Harlan Laboratories）
内皮细胞生长培养基（Lonza，目录号：CC-3162）+ 1％青霉素/链霉素（P/S）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140-122） >
胶原R（2mg/ml）（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：47254）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S-5761）
10x MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21430-020）
NaOH（Merck Millipore Corporation，目录号：1.06498）

设备

解剖显微镜（Motic Stereomicroscope K-400L）
层流罩
倒置显微镜
50 ml烧杯
25 mm磁性杆
磁力搅拌器
漂白额外的gillette剃刀刀片
剪刀（Fine Science Tools，目录号：14090-11）
Vannas-Tübingen弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号：15003-08）
2显微切割钳（VWR International，目录号：734-0448）
解剖板和针

程序

前一天
包裹解剖板在2个铝箔
消毒：烧杯，磁棒，刀片和解剖材料
放入冰箱：200μl提示盒，细胞培养板48孔

当日

主动脉环准备
1. 牺牲鼠CO 2吸入和斩首
2. 把老鼠的背部固定在解剖板上。
3. 用80％乙醇消毒皮肤。
4. 做一个Y形切口。
5. 打开腹腔。
6. 用剪刀剪切胸骨板和膈肌以暴露胸腔。
7. 将肠，肝，胃和脾位于右侧
8. 取出肺。
9. 主动脉沿着脊柱可见。
10. 消费税 ?主动脉开始于腹主动脉分成两部分的点动脉到主动脉弓使用剪刀平行放置脊柱和镊子（不伸展和机械损伤主动脉）。
11. 转移主动脉到充满培养皿在冰上补加1％P/S的无血清EBM-2培养基。全部以下步骤将在无菌条件下进行
12. 先前将主动脉固定到解剖板上去除第一张铝箔，并确保主动脉不会定期干燥加入无血清EBM-2培养基+ P/S
13. 下解剖显微镜，去除心脏主动脉纤维组织，残端侧支血管和血栓与Vannas-Tübingen春天剪刀和显微切割镊子
14. 当主动脉清洁时，将其转移到含有冷无血清EBM-2培养基的干净培养皿中，并保存在冰上。
15. 在切开胸主动脉之前准备胶原混合物。
16. 同时 ?在培养皿中，将胸主动脉横切成环 ?1至2毫米长度（20至25环/主动脉）使用剃刀刀片
17. 舍弃主动脉弓和主动脉的腹部。
18. 在培养皿中用冷的无血清EBM-2培养基更换培养基5次，以冲洗环。
将主动脉环嵌入胶原凝胶中
1. 将200μl的胶原溶液均匀地铺在每个的底部孔在预冷的48孔板中使用预冷的尖端
2. 将板放入CO 2培养箱（37℃）中30分钟以允许聚合。
3. 用镊子做一个戒指。
4. 通过小心地将其擦在空培养皿的侧面来干燥环
5. 将环放在聚合胶原的顶部的孔的中间
6. 对所有环重复此过程，但要尽可能快，以确保环不会变干
7. 使用预先冷却的提示，在主动脉环的顶部添加第二层200μl胶原混合物
8. 将板放回培养箱中。
9. 30分钟后，加入500μl无血清的EBM-2培养基补充或不补充感兴趣的药物。
量化
通过在倒置显微镜上以2.5×放大率培养7-8天后获得的图片手动进行微血管增生的定量。定量包括计数血管和分支点的数量（Nicosia和Ottinetti，1990）。计数过程的可视化呈现在Aplin等人（2008）中。

代表数据

图1.分离后8天，培养中不同时间（左上至左下）的一个主动脉环的代表性图片和用生长浓度的血管生成剂治疗的主动脉环（从左到右）的图片

笔记

一些孤立的细胞和血管开始出现约3-4天。一个发达的网络在回归前约7至9天可见
在本研究中，商业胶原基质已被使用，但它可以被纤维蛋白或Matrigel替代。然而，应当注意，包括成纤维细胞的非内皮细胞已经显示在Matrigel中组织成网络（Donovan等人，2001）。

食谱

胶原蛋白溶液
在缓慢搅拌下，在预先冷冻的试剂的50ml烧杯中制备胶原溶液，以避免气泡
1. 将1体积10×MEM与1.5体积186mM NaHCO 3混合，直至溶液的颜色变为橙色。
2. 加入7.5体积2mg/ml胶原蛋白R.
3. 加入几滴1M NaOH以达到pH 7.4（通过溶液中的颜色指示剂检查）。

致谢

该方案改编自Nicosia和Ottinetti（1990）和Blacher等人（2001）。本研究得到了心血管疾病研究协会和卢森堡文化，高等教育和研究部的支持。

参考文献

Aplin，A.C.，Fogel，E.，Zorzi，P。和Nicosia，R.F。（2008）。血管生成的主动脉环模型方法Enzymol 443 ：119-136。
Blacher，S.，Devy，L.，Burbridge，M.F.，Roland，G.，Tucker，G.，Noel，A.and Foidart，J.M。（2001）。改进大鼠主动脉环测定中血管生成的定量。血管生成 em> 4（2）：133-142。
Donovan，D.，Brown，N.J.，Bishop，E.T.and Lewis，C.E。（2001）。三种体外人类'血管生成'测定与毛细血管形成的比较< em 。 4（2）：113-121。
Nicosia，R.F.and Ottinetti，A。（1990）。大鼠主动脉无血清基质培养中微血管的生长。体外血管生成的定量测定。实验室投资 63（1）：115-122。