材料和试剂

Falcon 15ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-959-49D）
细胞培养/培养皿（100×20mm）（Thermo Fisher Scientific，Nunc ^{TM，目录号：172958）}
Falcon ^TM 50ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-432-22）
Costar ^? 24透明TC处理多孔板，Bulk Pack，Sterile（Corning，目录号：3527）
无菌过滤装置（0.1μm孔）（Merck Millipore Corporation，目录号：SCVPU02RE）
子宫内膜活检的采购
1. 来自生殖年龄妇女（年龄28-53）的子宫内膜活检（Chen等人，2013; Chen等人，2014年）中获得的。简而言之，正在接受良性妇科手术的妇女是同意捐赠他们的子宫内膜活检样品通过人类研究委员会（CHR）在UCSF（CHR Protocol，目录号： ?10-02786）。每个组织应确保适当的IRB 协议正在被利用。
消化介质（参见配方）
1. 胶原酶I [1gm /（249U/mg）]（Worthington Biochemical Corporation，目录号：LS004196）
2. 来自绵羊睾丸的透明质酸酶（856U/mg固体）（Sigma-Aldrich，目录号：H2251）
  注意：此产品已停产。一个可比的替代品是 Sigma-Aldrich H2126，等于kU/ml。可以使用其他只要U/mg是相当的产品/类透明质酸酶可比较，且产品具有类似的生物活性。
3. HBSS w/Mg 2+和Ca 2+ 2+，pH范围为6.7-7.8（UCSF细胞培养设施）。
4. HBSS w/o Mg 2+和Ca 2+ 2+，pH范围为6.7-7.8（UCSF细胞培养设施）。
5. Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（pH7.2）（PBS）（UCSF Cell Culture Facility）
6. 青霉素链霉素（Pen/Strep，1nM 1x工作溶液）（UCSF Cell Culture Facility）
传输介质（请参阅配方）
1. 胎牛血清（FBS）（Charocoaled/Dextran Stripped，无菌过滤，病毒和支原体测试）（Gemin Bio-Productsi，目录编号：100-119）
2. 具有微量元素的MCDB-105培养基（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：M6395）（参见配方）
3. 1N NaOH，细胞培养级（Sigma-Aldrich，目录号：S2770）
4. ddH sub 2 O
5. Pen/Strep
基质细胞培养基（SCM）（参见配方）
1. 不含酚红的DMEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：21063-029）
  注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21063-029"。
2. 丙酮酸钠溶液（1mM工作溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：S8636）
3. MCDB-105
4. FBS
5. 抗生素抗真菌剂（AB/AM，1nM 1x工作溶液）（UCSF细胞培养设备）
6. Gentamycin（gent，0.1nM 1x working solution）（UCSF Cell Culture Facility）
细胞培养材料和试剂
1. BioCoat ^TM Matrigel ^? Matrix Thin Layer 24 Well Clear Flat Bottom TC处理的多孔板（薄层100μg/cm 2）（Corning，目录号码：354605）
2. 40μm无菌细胞过滤器（装配到50ml Falcon管）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352340）
  注意：目前，它是"康宁，目录号：352340"。
3. 定义的角质形成细胞无血清培养基（KSFM）（Life Technologies， Gibco ^?，目录号：10785-012）[作为试剂盒的一部分，包括 ?生长补充剂（Life Technologies，Gibco ，目录号： 10784-015）]
  注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：21063-029和10784-015"。
4. Accutase细胞分离溶液（Merck Millipore Corporation，目录号：SCR005）
5. 红细胞裂解缓冲液（见配方）
  1. 氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：254134）
  2. 碳酸氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：237205）
  3. EDTA（500mM储备液）（Teknova，目录号：E0306）
6. PBS
7. 0.25％胰蛋白酶（UCSF细胞培养设备）

设备

旋转器（多旋转器）（任何旋转器都可以）（Biosan，型号：Multi-bio RS-24）
Fisherbrand 细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：22363547）
离心机（任何合适的离心机都可以）（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall Legend RT +离心机）
孵育器（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma 3110 CO 2水夹套组织培养箱）
血清移液器
无菌镊子，手术刀和其他手术工具（Thermo Fisher Scientific）
注意：不锈钢，完全可高温高压灭菌，适用于γ辐射灭菌。目前使用的集合的确切商品编号无法使用，但这些商品在供应商之间是相似的。
明场显微镜（反转细胞培养）

程序

组织消化程序
1. 子宫内膜活检应在15ml Falcon管中转移转移介质和在冷冻载体中（或在冰的存在下）包）。
2. 子宫内膜组织将在4°C保持稳定24小时，不需要立即处理
3. 准备15毫升Falcon管与5-7毫升1×消化培养基
4. 将组织和培养基转移到培养皿中。使用镊子和解剖刀轻轻地拉动子宫内膜离开子宫肌层利用全组织切片。丢弃子宫肌层。子宫内膜通过pipelle子宫内膜抽吸刮匙采购活检容易解剖并且不应该需要大量的力。将组织切成1 mm ³件。
5. 通过明场显微镜观察。当用a查看 ?50x晶状体，子宫内膜块将看起来黑暗与可见腺体/内腔碎片。上皮片段出现 ?有发光，蠕虫/珍珠项链样形态非上皮组织片呈现为黑色形状。上皮片段将看起来好像它们被"嵌入"在这些暗的形状中。在该放大率下也可观察到单个细胞
6. 使用2 ml-5毫升移液管拉起的碎片，并转移到一个新的15毫升猎鹰管。在300×g离心1-2分钟以沉淀子宫内膜组织和单细胞，弃去上清液，并在5-10中重悬 ?ml 1×消化培养基（10ml用于较大，2-3个管道通过活检）。
7. 在旋转器上孵育（10-20rpm，取决于模型）在37℃下1-2小时（可以使用无菌培养箱）。每15分钟轻轻摇动试管，以帮助消化
8. 消化的材料现在将主要包含单细胞和上皮片段（其由腔上皮细胞片组成 ?腺上皮）。与预消化相比，它们现在将出现 ?自由浮动而不是"嵌入"在黑暗的形状。如果未消化组织残留，通过转移仔细吸出这些碎片消化的物质进入培养皿。继续到A9。
9. 吸取消化的物质到一个40微米的细胞过滤器放置在一个开放的50毫升Falcon管的顶部
10. 流通液含有白细胞，子宫内膜干细胞和基质成纤维细胞的异质混合物。
11. 图1表示消化和分离程序的示意图
  
  图1.子宫内膜组织消化和细胞电镀程序
培养初级eEC
1. 转动过滤器，将过滤器反冲洗到带有PBS的培养皿中 ?颠倒并使用PBS洗涤保留的材料碟。内容物应包含腔和上皮片段。孵育培养皿与10ml的SCM的1:10稀释液 ?在PBS中。在这个过程中，称为选择性附着（Zhang et al。 ?1995; Kirk和Irwin，1980; Kirk等人，，1978），eSF将附于塑料培养皿中存在血清，而上皮片段将不附加。在37°C孵育1小时。在50x放大下，它可以识别污染的组织碎片，并将其移除使用移液管温和吸出。
2. 收集上皮碎片在15ml Falcon锥形管中，使用血清学移液管并离心以300×g离心5分钟以沉淀上皮片段。吸气1:10 稀释的SCM并用10ml限定的洗涤沉淀两次以上 KSFM以300×g离心5分钟以洗掉FBS的残余物。
3. （与步骤B2同时）将500μlKSFM加入24孔用Matrigel包被的板再水合Matrigel。在室温下孵育 30分钟后取出培养基。向孔中加入500μl新鲜的KSFM。
4. 在KSFM中重建沉淀。对于平均大小的子宫内膜 pipelle活检（一个子宫通过pipelle），3ml KSFM 适合于平均上皮产量。混合上皮片段用移液管并加入250-500μl的培养基上皮片段到每个孔中。对于平均尺寸pipelle 活检，应有足够的碎片平板?6-12口井。什么时候观察上皮片段，最好具有5-10个片段对于24孔板每孔50×放大倍数（图2A）。
  请注意，混合之后的片段很重要播种每个井，因为碎片会迅速沉淀。因此，我们建议 ?在移液之前将片段的本体溶液混合到每个中
  
  图2.子宫内膜细胞的明场显微镜 A.上皮片和碎片; B.初始附件的eEC到Matrigel; C. eEC生长在岛状群集中; D. 具有圆顶形状的富集的eEC单层; eEC文化与 ?eSF过度生长; F.汇流eSF。 50x放大
5. 腺体将在24小时内附着于Matrigel（图2B）。附属腺会扩散并生长成岛状簇（图2C）。最后这些细胞岛将形成一个主要的上皮单层。健康 ?eEC单层将在5-10天内变成融合，并形成圆顶状结构（图2D）。这些圆顶代表eEC单层折叠彼此。
6. 主轴样细胞的出现可能代表eSF污染。这种类型的eSF污染是常见的当培养上皮起源的细胞时。研究报告说，1-5％污染是常见的（Pierro等人，2001; Chen等人，2013），但是这种污染通常不影响eEC单层。 eSF中存在低钙环境如KSFM培养基最终变得不可行和分离。但是，有 eSF即使在次优条件下也会传播的可能性，超过eEC文化（图2E）。这些样品不可用应该被丢弃。
7. 可以使培养的细胞通过 ?一次，但不多于eEC据报道有限扩增潜能（Pierro等人，2001; Chen等人，2013; Chen等人 al。，2014）。要通过eEC，删除KSFM和孵化与Accutase （对于24孔板为500μl）在37℃下20-30分钟。
  请注意基于胰蛋白酶的试剂可能降低eEC活力，应该避免。在分离eEC后，在KSFM中洗涤两次（为了易于使用，它是可能将Accutase中细胞的所有孔集中到15ml Falcon中管）。添加等量的KSFM。再次以300×g旋转以除去上清液。重悬在KSFM的单细胞悬液。的体积将基于细胞密度而变化。平板1 x 10 ⁵ 每个随后的24孔Matrigel涂覆的板
培养主eSF
1. 在300×g离心过滤的单细胞悬液5分钟（来自步骤A9）以除去消化介质。如果需要，丸粒可以用红细胞裂解缓冲液处理1-2分钟，离心和 ?然后用PBS洗涤两次。用裂解缓冲液进行两次以上的处理不推荐。
  注意：这不是绝对必要的与裂解缓冲液，然而血液和粘液可能导致差 eSF文化的可视化。
2. 沉淀（主要包含eSF， ?而且还包括一些白细胞，干细胞和内皮细胞）然后重悬浮于SCM中，然后直接铺在10cm细胞培养物上培养皿。使用SCM选择eSF增殖同时不利于非eSF细胞的存活。板2-3×10 eSF进入陪替氏培养皿或5×10 4个细胞进入24孔板，取决于实验目标。 eSF汇合应在5天内完成（图2F）。
3. eSF可以使用基于胰蛋白酶的分离进行传代试剂。简言之，将铺板的细胞用PBS洗涤一次，并加入0.25％在培养箱中加入胰蛋白酶5分钟以分离eSF
4. 后用胰蛋白酶分离，用等体积中和胰蛋白酶 SCM。在300×g离心5分钟并在SCM中重悬。音量应根据活细胞计数进行相应调整。 eSF是现在准备电镀。
5. eSF可以常规传代到3-4。
  注意，可以从消化的其他细胞类型中分离单细胞物质通过流式细胞术分选如前报道（Chen et al。，2014）。

故障排除

我的eEC片段未附加到Matrigel。
1. 在播种eEC之前，Matrigel必须进行再水合
2. 增加播种密度（每50x观看区域的碎片）可能有所帮助。
3. eEC片段的过度种子也可抑制生长潜力（添加太多的片段将阻止最佳附着表面积， ?通常>每个视图区域10个碎片）。
4. 延长在Matrigel上的eEC孵育48小时，然后洗掉未附着的细胞
5. 患者使用基于孕激素的避孕药或存在慢性炎性子宫内膜疾病可能影响eEC生长潜在。
我的eEC文化正在被细菌/酵母菌/真菌污染。
1. 向KSFM添加工作浓度下的浓度或AB/AM可以减少外源污染
2. 增加选择性附着温育时间或增加更多 SCM（1:5稀释而不是1:10）稀释到选择性附着平板因为SCM含有抗生素。
我的eEC文化由于显着的eSF过度生长而变得不可行
1. 如果观察到大量的游离个体细胞紧接在电镀之前进行额外的用40μm细胞过滤器过滤步骤
2. 增加选择性附着培养时间。
我的eSF文化在原始培养中有一些残留的eEC。是这样吗？
1. 一些eEC片段可能不被过滤掉并保留在eSF中文化。这些eEC将在SCM媒体中受到损耗并成为不可行。
2. 在实验之前，将eSF另外传代至P2将确保纯eSF群体。

食谱

2x消化培养基
将156ml的HBSS w/Mg 2+和Ca 2+ 2 +组合到胶原酶I粉末中
加入3.12ml透明质酸酶（总共20kU）
加入3ml Pen/Strep（18.8nM工作浓度）
6.4mg/ml I型胶原酶
125 U/ml透明质酸酶（最终2x浓度）等分5毫升入15毫升Falcon管和在-20°C冷冻储存一年
对于1x工作溶液，在HBSS w/o Mg 2+ 2 + 和Ca <2> 中稀释1：1 注意：如果组织较大，需要更浓缩的消化，则无需稀释至1x。组织可以直接放入10ml 2×消化培养基中。还请注意，PBS或传输介质（见下文）可以替代HBSS w/o Mg ^{2 +} 和Ca sup> 2 + 作为稀释剂。
含微量元素的MCDB-105培养基
将1瓶MCDB-105与1L ddH 2 O 2混合加入15ml 1N NaOH，应使溶液变成粉红色
无菌过滤溶液
传输媒体
90％MCDB-105
10％FBS
1x Pen/Strep
基质细胞培养基（SCM）
加入5ml丙酮酸钠至500ml DMEM
67.5％DMEM
22.5％MCDB-105
10％FBS
1x抗生素/抗真菌剂（1nM工作浓度）和1倍剂量（0.1nM工作浓度）
红细胞裂解缓冲液
使用ddH 2 O 2制备 0.155M NH 4 Cl
0.01 M KHCO 3
0.1mM EDTA（pH7.3）

致谢

我们要感谢Linda C. Giudice博士，博士，Dr. Juan C. Irwin博士，医学博士，和Kim Chi Vo。这项工作部分由F32HD074423（JCC），K99AI104262（NRR）和来自NIH，加利福尼亚大学，旧金山 - 格兰德斯顿病毒学研究所的资助。 Immunology Center for AIDS Research，P30-AI027763（NRR）。

参考文献

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