材料和试剂

Rauvolfia nukuhivensis （Voucher JFB 2808）：在我们的示例中， R auvolfia nukuhivensis的树皮是在Maauu"TerreDéserte" Nuku Hiva Island，Marquesas群岛，法属波利尼西亚，海拔477米，由Jean-Fran?oisJean Butaud博士确认。凭证样本（JFB 2808）已存放在法属波利尼西亚的植物标本馆。使用空气干燥装置在30℃下收集样品后干燥，并储存在室内直到研磨和提取
乙醇（95％）（Thermo Fisher Scientific，Fisher chemical）
甲醇（来自Fisher chemical的HPLC级）
二氯甲烷（HPLC化学品的HPLC级）
环己烷（来自Fisher chemical的HPLC级）
乙酸乙酯（来自Fisher chemical的HPLC级）

设备

SEB预研磨机（SEB）
半制备型HPLC柱Luna 5μmC18（50mm x 10mm）（Phenomenex，型号：RP-C18）
真空液相色谱（Buchner过滤器，Buchi，用真空泵进行色谱）（BüCHILabortechnik AG）
高压液相色谱（HPLC）Waters 600系统，其配备有Waters 717 Plus自动进样器，Waters 998光电二极管阵列检测器（WATERS，型号：Waters 998光电二极管阵列检测器）和Sedex 75蒸发光散射检测器（SEDERE，型号： Sedex 75）
NMR光谱仪（Bruker公司，型号：Bruker Avance 500MHz）
偏光计（jascoinc，型号：Jasco P-2000）
分光偏光计（jascoinc，型号：Jasco J-810）
质谱仪（Bruker Corporation，型号：Bruker ESQUIRE 3000 plus）
Thermo Finnigan LTQ Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific）

程序

样品收集
分离程序开始于收集由植物学家识别并且用凭证样本的记录证明的样品。在我们的实施例中，在Maauu，在Nuku Hiva岛，Marquesas群岛，法属波利尼西亚的"TerreDéserte"地区，在477m的高度收集了毛霉菌的树皮，并由Jean-Fran?ois博士鉴定布托。凭证样本（JFB 2808）已存放在法属波利尼西亚的植物标本馆。使用空气干燥装置在30℃下收集样品后干燥，并储存在室内直到研磨和提取

提取和隔离
在萃取之前，将批次的50g树皮片在至少5个1分钟的重复研磨期间以转子设定在10,000rpm下研磨成粉末。为了避免研磨机过热，系统用塑料覆盖，并在每个研磨过程之间在冰中冷却。
根据粗提取物的化学复杂性，该过程可以分为三个步骤，即提取过程，一个或多个分馏步骤，以及最后的分离过程。对于我们的样品，进行两次连续分馏，使用表1和2中所述的一系列溶剂

图1.研磨过程之后和之前的Rauvolfia nukuhivensis的树皮

表1.第一次分馏的溶剂组成

分数	溶剂	比例
FA	水	-
FB	水/甲醇	1：1
FC	甲醇	-
FD	甲醇/二氯甲烷	1：1
FE	二氯甲烷	-

对于我们的植物的例子，其干燥的树皮（250g）设备
将干燥的树皮在750ml乙醇中浸渍16小时 ?，然后过滤（0.45μm）溶剂通过蒸发浓缩，得到粗油。
所结果的提取物（21g）通过在混合物中超声处理10分钟而溶解 200ml甲醇/二氯甲烷（1:1），然后过滤。
的在RP-C18 C18柱上通过真空液相色谱进行分离，并用极性递减的溶剂洗脱，如表1所示 ?1.
部分FC提供8.43g油状残留物，并通过HPLC-DAD显示吲哚生物碱的存在。

因此，进一步加入一部分级分FC（600mg）通过正相（二醇）快速柱色谱法分离增加极性的溶剂如表2所示。

表2.第二次分馏的溶剂组成

小部分	溶剂	Pro 部分
f1	环己烷	-
f2	环己烷/乙酸乙酯	3：1
f3	环己烷/乙酸乙酯	1：1
f4	环己烷/乙酸乙酯	1：3
f 5	乙酸乙酯	-
f6	乙酸乙酯/甲醇	3：1
f7	乙酸乙酯/甲醇	1：1
f8	乙酸乙酯/甲醇	1：3
f9	甲醇	-
f10	甲醇/二氯甲烷	1：1

每个获得的级分含有比提取物更低的化合物多样性，因此促进分离和纯化过程
选择级分FCf7在HPLC上进行最终纯化，主要是因为其重量，还具有高的化学多样性
FCf7（50.2mg）主要化合物的纯化通过RP-C18半制备型HPLC（Phenomenex，Luna 5μmC18,250mm×10mm）进行，用水/甲醇/三氟乙酸的梯度（从70:30： 0.1至30:70:0.1，流速3ml/min），在氮气流下干燥步骤后，得到纯的化合物1（4.7mg），2（2.8mg）3（1.83mg），4（2.17mg），5（3.25mg），6（3.24mg），7（1.23mg），8（6.43mg），9（1.82mg），10（1.71mg），11（1.39mg），12 （2.20mg）

表征
该方法的最后一步涉及不同的光谱和色谱技术，用于纯化化合物的完整描述。到目前为止，核磁共振（NMR）光谱是阐明化合物结构的最常用的技术。然而，需要其它技术与NMR一起以获得更好的表征，包括高分辨率质谱，UV光谱，旋光度，红外光谱和圆二色性（如果需要）。 NMR光谱通常以两种主要方式使用，1D和2D。为了更好地理解NMR光谱，参见例如Keeler（2011）; Lewitt（2001）和Fan（1996）。
在我们的情况下，我们选择研究并描述每种化合物的几种物理化学特性，如下所列：通过HPLC-DAD记录UV-Vis光谱。 NMR光谱在具有脉冲场梯度的Bruker Avance 500MHz光谱仪上测量，并且信号参照残余溶剂信号（CD 3 OD，at H < /s);3.31和δem} 49.0ppm）。对于该步骤，将每个稀释在700μlCD 3 OD中。分别使用Bruker ESQUIRE 3000 plus质谱仪和Thermo Finnigan LTQ Orbitrap质谱仪测量电喷雾离子化质谱（ESIMS）和高分辨率ESIMS（HRESIMS）数据。在配备有Waters 717 Plus自动进样器，Waters 998光电二极管阵列检测器和Sedex 75蒸发光散射检测器（Sedere，France）的Waters 600系统上进行HPLC纯化。在Jasco P-2000偏振计和Jasco J-810分光偏振计上分别测量旋光度和圆形显微镜。
Martin等人（2012）和Martin等人（2015）已??经报道了一些化合物的结构。这里提供了一些示例（图2）。我们还提供了在表3和4中总结的NMR光谱数据

图2.从伊红蠕虫的树皮提取物中分离的化合物1-13的结构。 Nukuhivensium（1）。黄色无定形粉末;通过HPLC/DAD（MeOH/H 2 O/TFA）测量的UVλmax 223,6; 241,3; 289,9; 340,0; 381.7nm; 1 H和13 C NMR，参见表3; HRESIMS m/z 261.13953 [M] + sup /（C 18 H 17 17 N 2的计算值）/sub> ⁺，261.13917）。 N ₁₂ -methylnukuhivensium（2）。黄色无定形粉末;通过HPLC/DAD（MeOH/H 2 O/TFA）测量的UVλmax 224.8; 236,6; 248,4; 286,7; 335,2; 392.6nm; 1 H和13 C NMR，参见表3; HRESIMS m/z 275.15417 [M] + sup /（C 19 H 19 N 2 N 2的计算值）/sub> ⁺，275.15482）。诺维胺（11）：淡黄色无定形粉末; [α] 20 D-1.1（MeOH）; 1 H NMR和13 CNMR光谱数据，参见表4; ESIMS m/z 343.1 [M + H] +; HRESIMS m/z 343.16611 [M + H] + sup /（C 19 H 23 N 23 N的计算值） 2 ⁺，343.16578）。淡黄色（12）浅黄色无定形粉末; [α] 20 D + 1.2（MeOH）; 1 H NMR和13 CNMR光谱数据，参见表4; ESIMS m/z 357.2 [M + H] +。 HRESIMS m/z 357.18289 [M + H] +的计算值（C 20 H 25 N 2 O 3） 2 4 ⁺，357.18143）。

表3. ¹ H（500 MHz）和 ¹³ 3 OD
中的吲哚喹啉衍生物1和2的C（125MHz） />

	Nukuhivensium（1）		N12 -methylnukuhivensium（2）
位置	δ 以ppm为单位	以ppm计，ppm。（ J 以Hz为单位）	δ 以ppm为单位	以ppm计，ppm。（ J 以Hz为单位）
1	120.5	8.65，s	121.5	8.96，s
2	154.4	-	154.1	-
3	124.4	7.83，d（7.0）	123.9	7.86，d（7.0）
4	137.6	9.19，d（7.0）	138.4	9.24，d（7.0）
6	128.1	8.84，d（7.0）	128.1	8.90，d（7.0）
7	117.2	8.61，d（7.0）	116.8	8.66，d（7.0）
7a	125.0	-	125.6	-
7b	122.5		128.9
8	123.3	8.36，d（8.0）	122.8	8.41，d（8.0）
9	122.9	7.50，dd（8.0; 7.0）	123.5	7.54，dd（8.0，7.0）
10	131.0	7.74，dd（8.0; 7.0）	131.2	7.83，dd（8.0,7.0）
11	113.6	7.84，d（8.0）	112.1	7.95，d（8.0）
11a	143.3		144.9
12			34.6	4.58，s
12a	131.7，C		131.4
12b	134.3，C		135.2
13	38.6，CH ₂	3.06，t（7.7）	38.7	3.09，t（7.7）
14	23.9，CH ₂	1.94，tq（7.7; 7.5）	24.4	1.93，tq（7.7，7.5）
15	14.0，CH ₃	1.12，t（7.5）	14.0	1.12，t（7.5）

表4. ¹ H（500 MHz）和 ^{/strong> 3 OD
中的大线衍生物11和12的C（125MHz） />
北京市（11）
。（12）

位置
δ 以ppm为单位
以ppm计，ppm。（ J 以Hz为单位）
δ 以ppm为单位
δ 以ppm计，mult。（ J 以Hz为单位）

2
126.9
-
n.d.
-

3
49.1
4.89，br s
47.8
5.08，br s

5
50.9
4.31，d（8.0）
51.2
4.26，d（7.5）

6α
25.5
3.52，dd（17.5,7.5）
25.0
3.50，dd（17.5，7.5）

6β
2.99，d（17.5）

7
107.7 / -
108.2
-

8
127.0
-
127.2
-

9
119.2
7.51，d（8.0）
119.8
7.51，d（8.0）

10
120.8
7.09，ddd（8.0,7.0,1.0）
121.3
7.09，brdd（8.0,7.0）

11
123.7
7.18，ddd（8.0，7.0，1.0）
124.2
7.25，br dd（8.0，7.0）

12
112.5
7.38，br d（8.0）
110.9
7.43，d（8.0）

13
138.1
-
139.8
-

14α
28.4
2.16，td（12.5，3.0）
28.3
2.20，td（12.5，3.0）

14β
2.02，br d（12.5）

15
30.2
2.17，m
30.6
2.11，br t（11.5Hz）

16
48.0
3.08，br s
49.3
2.93，m

17

-
n.d.
-

18
10.3
0.66，t（7.5）
10.7
0.71，t（7.5）

19
23.1
1.64，m
22.9
1.58，m

1.38，m
1.31，m

20
49.0
2.42，br t（7.5）
50.2
2.41，m

21
177.9
-
n.d.
-

CH ₃ - N ₁

29.3
3.73，s}

结论

我们的协议表明吲哚生物碱的隔离的重大改进。事实上，使用经典提取，非碱性化合物不会被提取，例如离子化合物如nukuhivensium。在改进结构，物理和化学特性的连续工作中，可以进行另外的NMR光谱，以描述一些化合物的相对构型，如NOESY实验。
该方案允许吲哚生物碱不同骨架以及立体异构体（正常和异构化合物，例如三明治和异维生素）和类似系列（正常和正化合物，如三明治和Norsandwicine）的不同结构的表征。因此，本文所述的方法更有效，并且需要更少的溶剂消耗时间。

致谢

我们要感谢方长安邀请我们写这篇手稿。作者感谢Diren（法国方面环境部）财政援助部门。这个协议已经写了Pr的伟大帮助。 Olivier P. Thomas，作者感谢他的工作和建议。

参考文献

Fan，T。（1996）。一维和二维的代谢分析复杂混合物的NMR分析。 161-219。
Keeler，J。（2011）。了解NMR光谱。 John Wiley&儿子。
Lewitt，M.H。（2001）。自旋动力学：核磁共振的基础。儿子。
Martin，N.J.，Ferreiro，S.F.，Barbault，F.，Nicolas，M.，Lecellier， G.，Paetz，C.，Gaysinski，M.，Alonso，E.，Thomas，O.P.，Botana，和Raharivelomanana，P.（2015）。来自Marquesan植物的Rauvolfia nukuhivensis的吲哚生物碱及其对离子通道的影响。 109：84-95。
Martin，N.J.，Prado，S.，Lecellier，G.，Thomas，O.P.and Raharivelomanana，P.（2012）。来自Marquesan植物的Rhovolfia nukuhivensis的Nukuhivensiums，indolo [2,3-a] quinoliziniums/em> 分子 17（10）：12015-12022。