材料和试剂

可互换注射器（Micro-Mate，目录号：148251A）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Micro-Mate?，目录号：148251A"。
尼龙3通旋塞阀（Kimble Chase，目录号：4201634503）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Kimble Chase?，目录号：4201634503"。
针（BD，目录号：305109）
一次性注射器（BD，目录号：309623）
DBA/1J小鼠（雄性，8周龄）
C57BL/6（雄性，8周龄）
牛胶原II型（Chondrex，目录号：20021）
鸡胶原II型（Chondrex，目录号：20011）
完全弗氏佐剂（CFA）（Chondrex，目录号：7008-1mg/ml和7001-4mg/ml）
不完全弗氏佐剂（IFA）（Sigma-Aldrich，目录号：F5506）
氯胺酮（KetaVed）（Vedco，目录号：078908598）
赛拉嗪（Anaed）（LLOYD，目录号：078081939）
冰乙酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：A38-212）

设备

过滤系统（Corning，目录号：431096）
Tailveiner Restrainer（Braintree Scientific，目录号：TV-150）
卡尺（Kafer，目录号：217901）

程序

胶原诱导的关节炎：用II型牛胶原免疫DBA/1J小鼠
牛胶原蛋白原液的制备
1. 在ddH 2 O中制备0.01N乙酸，并通过0.2μM膜过滤以对稀释剂灭菌。储存于4°C。
2. 用2.5ml 0.01N乙酸稀释10mg牛胶原，最终浓度为4mg/ml胶原。
3. 固定盖子并将胶原蛋白瓶包装在铝箔中，以避免暴露于光。
4. 在4℃下将瓶子旋转过夜，或直到胶原完全溶解
5. 等分胶原溶液（500μl等分试样），并在-20℃下冷冻
  1. 胶原蛋白的等分试样可以在-20℃保存6个月
  2. 等分试样在注射前不应解冻超过2次。
麻醉剂的准备
1. 制备25mg/ml氯胺酮和2.5mg/ml甲苯噻嗪的工作溶液在PBS中。将工作溶液在室温下储存2周，或1-3 个月。
  1. 对于10ml溶液，将2.5ml氯胺酮储液和0.25ml甲苯胺储液与7.25ml PBS混合。
  2. 每只小鼠将通过腹膜内（i.p.）注射0.1ml原液，最终浓度为2.5 ?mg氯胺酮和0.25mg xyalzine。
使用CFA进行第0天免疫的牛胶原乳液的制备
^*重要提示：在无菌组织培养罩中预成型
1. 将两个高压灭菌的2 ml玻璃路厄锁定注射器连接到三通活栓
2. 将玻璃柱塞放入其中一个注射器，并站在相反的位置注射器针对50毫升管架。带柱塞的注射器放置在罩的表面上，而第二注射器以90°放置 ?角度与注射器与柱塞（图1a）。
3. 创建一个通过加入4mg/ml胶原原料至0.01N的胶原工作溶液乙酸以1:1的比例在静置注射器中（图1b）。
4. 在注射器中以1:1的胶原工作溶液比例将CFA加入到注射器中。
  1. 实施例：500μl4mg/ml胶原，500μl0.01N乙酸和1ml CFA
  2. 工作解决方案和CFA的实际量将由 ?待免疫小鼠的数目，其中每个DBA/1J小鼠接受0.1ml ?的最终乳液
  3. 混合乳液将产生0.4ml的乳液在活塞中损失，一定要考虑到这一点当确定试剂的体积时。
5. 转动停止旋塞杆，关闭未连接到注射器的阀门开口。
6. 将柱塞放入站立式注射器中。
7. 混合溶液在两个注射器之间缓慢，通过突然整个溶液进入相对的注射器20次。这将创建一个白色乳剂（图1c）
8. 把所有的胶原蛋白倒入单注射器。当拿着包含胶原的注射器时（图1d），取下活塞并连接一个27号? ?英寸luer锁针到注射器的末端
9. 轻轻慢慢地降低柱塞，以从注射器中除去空气，直到胶原乳液填充针（图1e）。
10. 将胶原蛋白乳液放在冰上，远离光，直到免疫
  
  图1.注射器组件。将2个2 ml leur锁注射器与a 停止旋塞成90°角。将柱塞插入注射器垂直于站立式注射器。不要插入柱塞（A）。用胶原填充立式注射器工作溶液和CFA（B）。将柱塞插入支架注射器并将溶液交换到相对的注射器20次，直到白色乳液形成（C）。转动注射器，使leur-lock面并且整个乳液落在单个柱塞（D）上。取出没有乳液的止动阀和注射器，并组装注射器用27?'号针（E）
在CFA中用牛胶原乳液免疫DBA/1J小鼠：第0天
1. 用0.1ml注射的步骤A6a中所述的氯胺酮/赛拉嗪工作溶液麻醉每只小鼠。
2. 将完全麻醉的鼠标在尾部暴露的约束。
3. 向上转动针的斜面，并注射0.1毫升胶原乳液在尾部皮下，距离大约2厘米尾部的基部。小心不要注入尾静脉，因为这将导致死亡。
在IFA中制备和注射II型牛胶原蛋白乳胶的DBA/1J小鼠，用于第21天增强
1. 准备牛胶原乳液21天增强在相同的浓度作为第0天免疫，用CFA代替IFA。
2. 慢慢混合胶原蛋白，用与第0天免疫相同的方法组装针头。
3. 用0.1ml注射的步骤A6a中所述的氯胺酮/赛拉嗪工作溶液麻醉每只小鼠。
4. 将完全麻醉的鼠标在尾部暴露的约束。
5. 注入0.1毫升胶原乳液到小鼠的尾巴比原始注射部位更靠近尾部的基部如果从尾部的基部进一步施用增强注射比原来的注射点，关节炎可能发展缓慢，或者较少的增强注射给予更接近的基地尾巴。
胶原诱导的关节炎：用II型鸡胶原免疫C57BL/6J小鼠在C57BL/6J小鼠中引起CIA的程序在DBA/1J程序后建模，但包含两个主要变化。 C57BL/6J小鼠的免疫使用II型鸡胶原蛋白代替II型牛胶原蛋白。此外，对于C57BL/6J小鼠，CFA中MT的浓度从用于DBA/1J小鼠的1mg/ml增加至3-4mg/ml。所有其他详细信息与DBA/1J过程相同。
爪子测量和得分关节炎
1. 用异氟醚麻醉的滴剂麻醉麻醉小鼠（添加根据IACUC指南，约0.3ml至500μl容器）
2. 称重每只小鼠，对爪子进行评分，并在第0天测量爪厚度每周一次，直到第21天。第21天后，称重，测量和记分爪每周两次。
3. 按照以下标准对每只脚施加关节炎评分：
  1. 0：正常，无炎症或发红
  2. 1：一位数发红和肿胀
  3. 2：在一个以上的指中发红和肿胀，在一个指和踝和腕关节发红和肿胀。
  4. 3：所有手指和关节都有发红和肿胀
4. 通过测量爪厚度来记录爪肿胀的严重程度前爪的腕关节和后爪的踝关节。每个测量值应以mm为单位。
  1. 为了测量前爪，卡钳应该接触爪的后部和爪的"掌"（图2a）。
  2. 要测量后爪，应该将卡尺放在其上侧的踝关节，从一个测量踝关节的宽度 ?侧到另一侧（图2b）
    
    图2.爪子测量。通过将前爪放置在卡尺中以测量前爪，以便掌心并且爪的背部接触制动钳（A）的任一侧。读取测量 mm。通过将踝关节放置在卡尺中来测量后爪因此踝的任一侧接触卡钳（B）。读取测量 ?mm。
数据分析
1. 通过将每个爪子的得分加在一起来绘制关节炎得分数据，最大得分为12.
2. 在XY图中显示数据，其中Y是关节炎评分，X是免疫后的天数（图3a）
3. 通过从原始第0天的厚度减去爪的厚度（mm）来绘制测量数据
4. 在XY图中显示数据，其中Y以mm为单位膨胀，X是免疫后的天数（图3b）

代表数据

图3.在第0天用CFA中的II型牛胶原免疫DBA/1J小鼠，并在第21天用IFA中的II型牛胶原增强。在疾病过程中，关节炎评分归于每只小鼠的每只爪子，基于C节中描述的特征。每只小鼠的得分总计为每只小鼠的0-12分（A）。还测量每个爪的厚度，并绘制以mm为单位的爪厚度的增加（B）。显示的结果代表三只个体小鼠。

致谢

这项工作得到国家卫生研究院关心和肌肉骨骼和皮肤疾病国家研究所（NIAMS-NIH）的支持，奖号为1R01AR063132。

参考文献

Brand，D.D.，Latham，K.A。和Rosloniec，E.F。（2007）。胶原诱导的关节炎 Nat Protoc 2（5 ）：1269-1275。
Crook，KR，Jin，M.，Weeks，MF，Rampersad，RR，Baldi，RM，Glekas，AS，Shen，Y.，Esserman，DA，Little，P.，Schwartz，TA和Liu，。骨髓衍生抑制细胞在自身免疫性疾病期间调节T细胞和B细胞反应。 em J J Leukoc Biol 97（3）：573-582。
Inglis，J.J.，Simelyte，E.，McCann，F.E.，Criado，G.and Williams，R.O。（2008）。 C57BL/6小鼠中关节炎诱导的方案。Nat Protoc 3（4）：612-618。