材料和试剂

无菌9厘米正方形植物培养基培养皿
盖玻片No 1.5（VWR International，目录号：631-0125）
带有磨砂端的显微镜载玻片（VWR International，Superfrost ，目录号：631-0114）
安全密封粘合片（0.12mm厚）（Grace Bio-Labs，Inc.，目录号：620001）
表达用PA-GFP标记的感兴趣蛋白质的拟南芥品系（Patterson和Lippincott-Schwartz，2002）
注意：在我们的情况下，为了测量根干细胞中的组蛋白交换动力学，我们将H2B-PAGFP构建体置于根细胞特异性启动子（pSCR）（Rosa等人，2014）的控制下，其导出表达同时在静止中心细胞，内皮层/皮层初始和根内皮层。这种设置允许我们比较多能干细胞中的组蛋白蛋白质的动力学，因为它们进入更多的分化状态。在此协议中，我们不会提及特定的细胞或组织，因为该程序可应用于根中的任何细胞类型。
Murashige&具有维生素的Skoog基础培养基（任何等效来源将是合适的）（PhytoTechnology Laboratories ，目录号：M519）
在dH 2 O（Vortex，Procter& Gamble）中的10％漂白剂（含有5-10％次氯酸钠）
（pH 5.8）（forMedium ^TM）
蔗糖（Sigma-Aldrich）
Phytagel（Sigma-Aldrich，目录号：P8169）
Murashige和Skoog培养基（见配方）

设备

植物生长室
在Ultima双光子激光扫描显微镜（Buker Coopration，Prairie Technologies，型号：Ultima 2-Photon显微镜）上进行双光子光活化实验。
注意：使用Olympus 60x 0.9 NA水浸物镜以512 x 512分辨率（0.203μm/像素）和1μm聚焦台阶获取实时图像。
层流柜

软件

ImageJ软件
MS Excel
Graphpad棱镜软件

程序

植物生长和显微镜载玻片准备
1. 表面消毒种子在5％v/v次氯酸钠中5分钟，并在无菌蒸馏水中漂洗三次。
2. 将种子置于补充有1％w/v蔗糖和0.5％w/v Phytagel的Murashige和Skoog培养基（pH5.8）上。
3. 通过在4℃下在黑暗中孵育2天来分层种子然后在25℃下在垂直取向的Petri中在连续光下生长菜肴约3-5天。
4. 载玻片准备：切小方形框架的安全密封胶具有相似的尺寸盖滑动并粘贴到幻灯片（这将避免挤压根部之间的滑动和盖滑动并防止蒸发在成像期间安装介质）（图1）
5. 从拟南芥苗切根尖，同时仍然在板上，并放置在显微镜幻灯片包含一滴水。或者，如果幼苗 ?不是太大，整个幼苗可以安装在幻灯片上。我们每个幻灯片通常安装1-2根，但只使用其中一个 ?1小时的时间过程，因为我们试图避免材料太长实验前的幻灯片
6. 添加盖玻片，并用胶带将其粘贴到幻灯片。
  
  图1。 A.显微镜载片准备示意图。拟南芥根尖（星号），并置于载玻片上。 B.显示的图像在根中选择用于光激活的区域（从1到9标记）表达H2B-PAGFP。在光激活之前核显示非常弱信号（参见步骤B4）。比例尺=5μm
成像
1. 在Ultima上进行双光子光活化实验双光子激光扫描显微镜。使用a。获得图像 Olympus 60x 0.9 NA水浸物镜
2. 使用2.5倍光学变焦和512×512分辨率
3. 设置1μm的Z级。
4. 在光活化之前不存在荧光使得它是不可能识别感兴趣的区域，因此是初始的预激活是必要的。这种微弱的预激活是通过在850nm波长，50％功率和一个像素下扫描根尖时间为5.6μs。根据根目录，需要进行一次或两次扫描（图1B）。
5. 对于光活化同时定义几个感兴趣区域（ROI）覆盖不同的每个核的一半 ?Z位置。使用710nm激光以30％功率脉冲ROI 像素时间为8.8μs。重复此循环两次，然后设置正常时间序列。
6. 对于PA-GFP时间序列成像使用925 nm激光线以50％功率，8.8μs/像素，具有一个采集（一个 z-堆叠，相同的z-步骤）每60秒1小时。
图像处理
1. 使用Image J软件进行图像分析
2. 打开超栈（包含 z 和 t 维度）并应用Z-stack最大投影。
3. 预期细胞运动和/或漂移将发生在期间图像采集。这些运动可以通过校正和/或消除 ?使用Image J的StackReg插件对齐连续的帧插件通过互相关过程对连续图像帧进行对齐，它工作容易，无需操作员干预，只要运动不会太大。更多详细信息，包括屏幕截图可在开发者的网站上。（ http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）
4. 一旦图像 alignment使用来自Image J的"ROI管理器"工具定义三个区域感兴趣的是：Photoactivation Region;总核和背景（图2A）。光活化和总核区域都是基于荧光的对比度手工绘制。因为平均强度被测量，每个区域的确切轮廓不是关键的结果。
5. 一旦三个区域被加载到"ROI"上管理器"窗口单击"多测量"，结果表将提供有在不同的每个区域的平均强度值 ?时间点。这些测量将在以后用于归一化数据。
数据分析
1. 将原始强度测量导出到Microsoft Excel以执行双归一化（Phair等人，2004）。此方法规范化初始荧光变为"1"，并校正成像期间的漂白（图2）。
  
  图2.相对荧光信号的测定在ROI区域，以及背景和漂白校正成像
2. 对比例进行归一化也很重要 ?的被激活的细胞核（图3）。在我们的情况下因为一半的核被激活，荧光衰减只能达到大部分的初始荧光。因此，我们把它通过进一步归一化如下：I（norm）= （F sub -F sub）/2）/（F sub 0/2），其中F sub是第荧光强度点（t）和F 0 0是后的初始荧光强度光活化
  
  图3.校正激活的核的比例
3. 将标准化的数据复制到程序，如GraphPad Prism和执行曲线拟合分析。使用非线性回归和a 单指数衰减函数（图2C）。流动分数（Mf）和半衰期值（荧光强度所需的时间达到平稳水平的最大值的一半）软件。
4. 现有数据为平均值±SEM，并通过t检验评估统计学显着性注意：关于不同发育阶段衰变的例子可以在我们的出版物中找到（Rosa et al。，2014）。
  
  图4.光敏化实验的示例 A.建立三个ROI用于分析（光活化区，总核和背景）。核中的代表性荧光变化内皮细胞表达H2B-PAGFP。一半的核光活化（710nm激光线）和其内的荧光损失测量活化面积。 C.描绘的核的衰变曲线 B.数据对应于光活化的荧光强度区域（1）。在红色，非线性回归中使用a 单指数函数。

食谱

Murashige和Skoog培养基
0.025mg/L CoCl 2 。 6H 2 O 0.025mg/L CuSO 4 5H O 36.7mg/L Na Fe-EDTA
6.2mg/L H sub 3 BO 3 sub 0.83mg/L KI
16.9mg/L MnSO 4 。 2H 2 0.25mg/L Na 2 SO 4 MoO 4+。 2H 2 O 8.6mg/L ZnSO 4·7H 2 O 7H/SiO 2。 332.02mg/L CaCl 2 。 2H 2 O
170mg/L KH 2 PO 4 sub/
1,900mg/L KNO 3
180.5mg/L MgSO 4 .7H 2 O 2 1,650mg/L NH 4 NO 3（PH 5.8）
1％蔗糖 0.5％植物凝集素

致谢

我们感谢Nuno Moreno对葡萄牙Gulbenkian deCiênciaInstituto的多光子显微镜的帮助。这项工作得到了英国生物技术和生物科学研究委员会（授予BB/D011892/1和BB/J004588/1）授权（SFRH/BD/23202/2005）由葡萄牙语基础技术委员会）和约翰·因尼斯基金会。

参考文献

Patterson，G.H。和Lippincott-Schwartz，J。（2002）。一种可光活化的GFP，用于选择性地标记蛋白质和细胞。科学< em> 297（5588）：1873-1877。
Phair，R.D.，Gorski，S.A.和Misteli，T。（2004）。使用光漂白显微镜测量体内动态蛋白与染色质结合的强度。 Methods Enzymol 375：393-414。
Rosa，S.，Ntoukakis，V.，Ohmido，N.，Pendle，A.，Abranches，R。和Shaw，P。拟南芥中的细胞分化和发育与组蛋白动力学的变化有关单核细胞水平。植物细胞 26（12）：4821-4833。