材料和试剂

无菌纸巾
无菌手术垫（Direct Resource，目录号：19015742）
23号（或25-/26号）针（BD Biosciences，目录号：305145）
10ml注射器（BD Biosciences，目录号：309604）
70μm尼龙细胞过滤器（Falcon，目录号：352350）注意：目前，"Corning，Falcon ^? ，目录号：11995-065"。 />
50ml锥形管（Falcon，目录号：21008-940）
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5ml注射器柱塞（BD Biosciences，目录号：309646）
成年小鼠（> 6周，任何菌株）（例如C57BL/6）
Hank's平衡盐溶液（HBSS），无钙，无镁，无酚红（Life Technologies，目录号：14175095）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：14175095" />
DMEM培养基，高葡萄糖，丙酮酸盐，L-谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：11995-065）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：11995-065"
70％乙醇
胎牛血清热灭活（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F9665）
氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：213330）
碳酸氢钾（KHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：237205）
乙二胺四乙酸二钠（Sigma-Aldrich，目录号：D2900000）
RBC裂解缓冲液（参见配方）
DMEM介质（参见配方）

设备

平头无菌剪刀（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：08-950）
Sharp无菌剪刀（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：08-940）
无菌钳（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：08-890）
（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：02-671-55A）或coulter Z2细胞和颗粒计数器（Beckman Coulter，目录号号码：383550）
冷冻离心机
无菌培养罩
CO 啮齿动物安乐死室

程序

用CO 2安乐死小鼠，并在无菌罩中将小鼠放在无菌手术垫上。用70％乙醇灭菌小鼠腹部区域和后肢的皮肤（图1）。

图1.小鼠腹部区域和后肢皮肤的消毒
用钝端无菌剪刀打开腹腔，取出表面肌肉，找到骨盆 - 髋关节（图2）。

图2.找到骨盆 - 髋关节。骨骼解剖参考： http://www.informatics.jax.org /cookbook/figures/figure41.shtml
用锋利的无菌剪刀剪断髋 - 髋关节上方的后腿（图3）。用锋利的无菌剪刀从膝关节下方的后腿切下胫骨（图4）

图3.切断骨盆 - 髋关节上方的后腿

图4.在膝关节处切断胫骨
（可选）如果需要更高的骨髓细胞产量，胫骨也可用于骨髓细胞分离。切开胫骨踝关节解剖胫骨。以下程序可应用于股骨和胫骨。
用无菌镊子和剪刀去除股骨周围的肌肉和残留组织（图5）

图5.去除股骨周围的肌肉和残留组织
用锋利的无菌剪刀剪两端的股骨（图6）。使用23号（一些文献建议25或26号）针和充满冰冷HBSS的10毫升注射器冲洗骨髓出70毫米尼龙细胞过滤器放置在一个50ml Falcon锥形管（图7）。使用所有10 ml HBSS或直到流量变为白色

图6.两端切割股骨

图7.用HBSS
将骨髓冲洗到细胞滤网上
（任选的）在一些残余物骨髓细胞不能被冲洗掉的情况下（在流过物中可见的骨髓非常少，或者产率明显更低，例如<1/10> <1×10 7 细胞），用针刮伤股骨的内表面并用额外?5ml的HBSS冲洗（图8）。

图8.（可选）用针头刮伤股骨内表面
用5ml柱塞将骨髓粉碎通过细胞过滤器（图9）。用另一个?5ml的HBSS洗涤过滤器

图9.用5 ml柱塞捣碎细胞过滤器的骨髓细胞
在4℃下以1,500rpm离心细胞7分钟。弃去上清液并在纸巾上吸干（图10）。

图10. RBC缓冲液重悬之前的细胞沉淀
用1ml RBC裂解缓冲液（每只小鼠）重悬细胞沉淀。在室温孵育5分钟或在37℃孵育2分钟，并通过加入5ml FBS中和裂解缓冲液。
在4℃下以1,500rpm离心细胞7分钟。弃去上清液并在纸巾上吸干。用适当的培养基重悬细胞沉淀，用于下一步测定，例如5ml含有10％FBS的DMEM培养基。然后将细胞置于冰上。
用血细胞计数器或Beckman Z2 coulter计数器计数骨髓细胞。细胞准备用于测定或培养。细胞可以在冰上保持活力至少5小时。建议在分离后立即进行实验（培养或测定）以获得最佳结果。

食谱

RBC裂解缓冲液
0.16 M NH 4 Cl，10mM KHCO 3和0.13mM EDTA，溶解在无菌H 2 O中，并在4℃下储存。
对于500ml，4.28g NH 4 Cl，0.5g KHCO 3，0.024g EDTA二钠
建议为实验准备新鲜的RBC裂解缓冲液。 RBC裂解缓冲液在4℃下稳定至少1个月
DMEM培养基
DMEM培养基，高葡萄糖，丙酮酸盐，L-谷氨酰胺，补充有10％FBS 储存在4°C

致谢

该协议根据以前的研究，包括下面参考文章修订，并得到宁泉的NIH资助（R21 MH099482）的支持。

参考文献

Madaan，A.，Verma，R.，Singh，A.T.，Jain，S.K.and Jaggi，M。（2014）。分离小鼠骨髓和产生树突状细胞的分步程序 J Biol Methods 1（1）：e1。
Weischenfeldt，J。和Porse，B。（2008）。骨髓来源的巨噬细胞（BMM）：隔离和应用 CSH Protoc 2008：pdb prot5080。