材料和试剂

UV-Star microplate（96孔）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655801）
纯化的重组His标记的< em> Zg FK
注意：该蛋白质在含有重组pFO4_ZgFK载体的大肠杆菌BL21（DE3）中产生，如Groisillier等人，（2010）所述。通过使用HisPrep FF 16/10柱（GE Healthcare Dharmacon）的亲和层析将该重组蛋白质纯化到?ktaavant系统（GE Healthcare Dharmacon）上。完整的纯化方案在Groisillier等人（2015）中有详细描述。
来自兔肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：P0294）
MilliQ水
磷酸（烯醇）丙酮酸三（环己基铵）盐（Sigma-Aldrich，目录号：P7252）
（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
4-吗啉乙磺酸（MES）（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
Bis-Tris（Sigma-Aldrich，目录号：B9754）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原二钠盐水合物（NADH）（Sigma-Aldrich，目录号：N8129）
要测试以评估底物特异性的化学品的实例：
1. D - （ - ） - 果糖（Sigma-Aldrich，目录号：F0127）
2. D-（+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
3. D - （+） - 甘露糖（Sigma-Aldrich，目录号：M4625）
4. D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M9647）
5. D-山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
6. D-甘露醇-1-磷酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：92416）
7. D-果糖-1-磷酸（Sigma-Aldrich，目录号：S408689）
8. α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：G9380）
9. D-甘露糖-6-磷酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：M3655）
10. D-葡萄糖-6-磷酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：G7879）
11. D-果糖-6-磷酸二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：F3627）
12. 腺苷5'-三磷酸（ATP）二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：A1852）
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（见配方）
100mM MgCl 2（参见配方）
1 M KCl（见配方）
100 mM PEP（参见配方）
100 mM ATP（参见配方）
10 mM NADH（参见配方）
PK/LDH（参见配方）

设备

Safire2紫外分光光度计酶标仪（Tecan Trading AG）
NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）

软件

Hyper 32（Hyper32.software.informer.com）
Microsoft Excel

程序

反应混合物含有100mM Tris-HCl（pH7.5），1mM果糖，1mM ATP，100mM KCl，1.5mM MgCl 2，1mM磷酸烯醇丙酮酸（PEP），0.5mM新鲜制备的NADH ，0.2μl丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶（PK/LDH）酶（使用前保存于-20℃）和1?10μg纯化的重组酶，体积为100μl。空白对应于反应混合物，其中底物被MilliQ水代替（表1）
表1.用于测定Zg FK活性的空白和反应混合物的组成

库存解决方案	μl以空白添加	μl加入反应混合物（试验）
Tris-HCl（pH7.5）（1M）	10	10
果糖（25mM）	0	4
ATP（100mM）	1	1
MgCl 2（100mM）	1.5	1.5
KCl（1 M）	10	10
PEP（100mM）	1	1
NADH（10mM）	2	2
PK/LDH（600-1,500单位/ml）	0.2	0.2
Zg FK（1μg/μl）	1	1
MilliQ水	73.3	69.3

通过加入底物开始连续测定反应，通过在Safire2UV分光光度计酶标仪中在340nm处的吸光度的变化（其对应于NADH到NAD +的转化）测定活性。该测定在25℃下进行最多20分钟。只有曲线的早期线性部分用于计算活动（图2）。
使用公式计算NADH的消耗：
[（ΔA340nm测试-ΔA340nm空白）/（t * 6220 * 0.3 * 0.0001）]
其中
ΔA340nm <=孵育期间的吸光度变化
t =培养持续时间（min）
6220 = NADH的消光系数（L mol ^-1 cm ^-1）
0.3 =光程（cm）
0.0001 =测定体积（L）
NADH的减少速率与乳酸盐的形成速率成正比，因此与FK活性成正比。 FK活性的一个单位（U）对应于每分钟氧化的1μmolNADH

图 ?曲线的早期线性部分表示吸光度的变化（340 ?nm）在果糖存在下作为时间（秒）的函数监测。曲线分别表示在0和5mM果糖下的两个系列的三次重复。
为了计算比活性，将在上述等式中获得的值除以样品中存在的 Zg FK蛋白的量。对每个测定进行三次重复，并确定平均值±S.E。（参见注释）。这也适用于下述实验。作为实例，在5mM果糖存在下，Zg/FK的比活性的典型值为0.49U/mg。
为了测定底物特异性，在"材料和试剂"部分列出的每种底物存在下，使用1mM至至少100mM的浓度评价Zg/FK活性。
为了确定最佳pH，用在不同pH下制备的其它缓冲液替换在步骤1中使用的100mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液。作为指示，可以使用：
100mM MES，pH 5.5,6，6.5
100mM Bis-Tris丙烷，pH6.5,7,7.5,8,8.5,9,9.5。
100mM Tris-HCl，pH 7,7.5,8,8.5,9mM
为了确定最佳温度，将步骤1中所述的反应混合物在例如10℃至50℃的温度范围内，以5℃或10℃的增量温育。
为了检查NaCl的影响，在步骤1中描述的反应混合物中加入氯化钠以获得范围从0至2μM的终浓度。
为了估计所选底物S的酶的动力学参数，在至少五种不同浓度的该底物和固定浓度的ATP的存在下进行单独的酶反应。确定每个反应的初始反应速率，并绘制1/V对1/[S]，以获得Lineweaver-Burk图，其中对于S来说K sub和V sub可以计算。

图3.用于测定K m（10mM）和V m（2.55U/mg）的Lineweaver-Burk图， [S]是果糖浓度（以mM计），V是反应速率（以μmol/min/mg蛋白质计）。

笔记

PK/LDH酶活性必须在选择的测定条件（温度，pH，盐浓度...）下与供应商推荐的活性（一个单位在pH 7.6在37℃下转化1.0μmole底物每分钟）进行比较。如果这些活动发生改变，请按照两个步骤进行操作：首先，在选择的条件下（无PK/LDH酶，PEP和NADH）进行果糖激酶反应不同的温育时间;然后，在第二步中，在这些不同的孵育时间之后测量[NADH]，并绘制如图2所示的结果。
在确定给定底物S的K m和V m之前，确保辅因子（ATP）过量，即 V不是随着反应混合物中辅因子的量增加而增加;在确定辅因子的Km和Vm之前，确保S是过量的，即V不随反应混合物中S的量增加而增加。在理论上，饱和浓度相当于100K m，但是10K m/s通常是足够的（Bisswanger，2014）。然后需要调节Fg浓度和孵育时间以获得在340nm处的吸光度的线性降低，即， NADH的线性消耗
S.E对应于在Excel中计算的标准误差

食谱

1 M Tris-HCl（pH 7.5）
在室温下贮存
100mM MgCl 2/v/v 在室温下贮存
1 M KCl
在室温下贮存
100mM PEP
在使用一周后在MilliQ水中新鲜制备并储存在-20℃下
100 mM ATP
在使用当天在MilliQ水中新鲜制备
10mM NADH
在使用当天在MilliQ水中新鲜制备
PK/LDH
储存于-20°C

致谢

该方案由Groisillier等人（2015）进行。这项工作得到了法国国家研究机构通过投资支出计划IDEALG（ANR-10-BTBR-02）的支持。我们还感谢émergence-UPMC-2011研究计划的资助。

参考文献

Bisswanger，H.（2014）。酶学测定。 1：41- 55.
Gro?illier，A.，Herve，C.，Jeudy，A.，Rebuffet，E.，Pluchon，PF，Chevolot，Y.，Flament，D.，Geslin，C.，Morgado，IM，Power，D.，Branno， M.，Moreau，H.，Michel，G.，Boyen，C.and Czjzek，M。（2010）。 MARINE-EXPRESS：利用高通量克隆和表达策略进行海洋后基因组分析 Microb Cell Fact 9：45。
Groisillier，A.，Labourel，A.，Michel，G.and Tonon，T。（2015）。海洋细菌Zobellia galactanivorans的甘露醇利用系统。 Appl Environ Microbiol 81（5）：1799-1812。