材料和试剂

UV-Star microplate（96孔）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655801）
纯化的重组His-标记的Zg M2DH
注意：如Groisillier等人（2010）所述，该蛋白质在含有重组pFO4_ZgM2DH载体的大肠杆菌BL21（DE3 em）中产生。通过使用HisPrep FF 16/10柱（GE Healthcare Dharmacon）的亲和层析将该重组蛋白质纯化到?ktaavant系统（GE Healthcare Dharmacon）上。完整的纯化方案在Groisillier等人（2015）中有详细描述。
Trizma底物（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
MilliQ水
4-吗啉乙磺酸（MES）（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
Bis-Tris（Sigma-Aldrich，目录号：B9754）
要测试以评估底物和辅因子特异性的化学品的实例：
1. D - （ - ） - 果糖（Sigma-Aldrich，目录号：F0127）
2. D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
3. D - （+） - 甘露糖（Sigma-Aldrich，目录号：M4625）
4. D - （+） - 半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G0750）
5. D - （+） - 木糖（Sigma-Aldrich，目录号：X1500）
6. D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M9647）
7. D-山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
8. D - （+） - 阿拉伯糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：A3381）
9. β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（β-NAD）（Sigma-Aldrich，目录号：N1636）
10. β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水合物（β-NADP）（Sigma-Aldrich，目录号：N5755）
11. β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原二钠盐水合物（β-NADH）（Sigma-Aldrich，目录号：N8129）
12. β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原四（环己基铵）盐（β-NADPH）（Sigma-Aldrich，目录号： N5130）
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（见配方）
10 mM NADH（参见配方）
10 mM NAD ⁺（参见配方）

设备

Safire2紫外分光光度计酶标仪（Tecan Trading AG）
NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）

软件

Hyper 32（hyper32.software.informer.com）
Microsoft Excel

程序

标准果糖还原反应混合物含有100mM Tris-HCl（pH6.5），1mM果糖，0.2mM NADH和1至10μg纯化的重组酶，最终体积为100μl。标准甘露醇氧化反应混合物在100μl中含有100mM Tris-HCl（pH8.5），1mM甘露醇，0.5mM NAD +和1至10μg纯化的酶。空白对应于反应混合物，其中底物被MilliQ水代替（表1）
表1.用于测定 M2DH活性（果糖降低）的空白和反应混合物的组成

库存解决方案	μl以空白添加	μl加入反应混合物（试验）
Tris-HCl（pH6.5）（1M）	10	10
NADH（10mM）	2	2
果糖（25mM）	0	4
Zg M2DH（1μg/μl）	1	1
MilliQ水	87	83

通过加入底物开始连续测定反应，并通过在Safire2UV分光光度计酶标仪中随后在340nm处的吸光度变化监测活性，其对应于NADH的减少或产生。反应在25℃下进行最多20分钟。只有曲线的早期线性部分用于计算活动（图2）。

图 ?2.曲线的早期线性部分代表吸光度（340nm）在甘露醇存在下作为时间（秒）的函数进行监测。曲线分别表示在0和0.5mM甘露醇的两个系列的三次重复。
分别基于NADH的减少或产生的果糖还原和甘露糖醇氧化活性使用下式计算：
[（ΔA340nm测试-ΔA340nm空白）/（t * 6220 * 0.3 * 0.0001）]
其中
ΔA340nm <=孵育期间的吸光度变化
t =培养持续时间（min）
6220 = NADH的消光系数（L mol ^-1 cm ^-1）
0.3 =光程（cm）
0.0001 =测定体积（L）
两种活性（果糖还原或甘露醇氧化）的一个单位（U）对应于每分钟还原或氧化的1μmolNADH。
为了计算比活性，将在上述方程式中获得的值除以在反应混合物中加入的MdDH蛋白的量。对每个测定进行三次重复，并确定这三个重复的平均值±S.E。（参见注释）。这也适用于下述实验。作为实例，在10mM果糖存在下，Zg M2DH的比活性的典型值为3.95U/mg。
为了确定底物特异性，使用在1mM至至少100mM的浓度范围内，在"材料和试剂"部分中列出的每种底物存在下测试Zg M2DH活性。
为了确定最佳pH，用在不同pH下制备的其他缓冲液替换在步骤1中使用的100mM Tris-HCl（pH8.5或6.5）缓冲液。作为指示，可以使用：
100mM MES，pH 5.5,6，6.5
100mM Bis-Tris丙烷，pH6.5,7,7.5,8,8.5,9,9.5。
100mM Tris-HCl，pH 7,7.5,8,8.5,9mM
为了确定最佳温度，在步骤1中使用的反应混合物在例如10℃至50℃的温度范围内，以5或10℃的增量孵育。
为了评估各种金属离子和化学物质对Zg/M2DH活性的影响，在步骤1所述的反应混合物中分别加入不同浓度的金属离子或化学物质。实施例在表2中给出。

表2.金属离子和化学物质对潜在影响Zg M2DH活性的测试。甘露醇，果糖，甘露醇-1-磷酸和果糖-6-磷酸以高的浓度以评估对酶活性的潜在抑制作用
为了估计所选底物S的酶的动力学参数，在至少五种不同浓度的该底物和固定浓度的NAD（H）的存在下进行单独的酶反应。确定每个反应的初始反应速率，并绘制1/V对1/[S]，以获得Lineweaver-Burk图，其中对于S来说K sub和V sub可以计算（图3）。

图3.用于测定K m（1.12mM）和V m（7.18U/mg）的Z meweaver-Burk图， M2DH代表甘露醇。 [S]是甘露醇浓度（以mM计），V是反应速率（以U/mg蛋白质计）。

笔记

在确定给定底物S的K m和V m之前，确保辅因子[NAD（H）]过量，即 V不随反应混合物中辅因子的量增加而增加;同样地，在确定辅因子的K sub和V sub之前，确保S是过量的，即，表明V不是随着反应混合物中S的量增加而增加。理论上，饱和浓度等于100公里，但10公里通常就足够了（Bisswanger，2014）。然后需要调整M 2 DH浓度和孵育时间，以获得在340nm处的吸光度的线性变化，即NADH的线性变化。< br />
S.E对应于在Excel中计算的标准误差。

食谱

1 M Tris-HCl（pH 7.5）
在室温下贮存
10mM NADH
使用当天在水中新鲜制备
10 mM NAD ⁺
在使用一周后在MilliQ水中新鲜制备并储存在-20℃下

致谢

该方案由Groisillier等人（2015）进行。这项工作是由法国国家研究机构通过投资支出方案IDEALG（ANR-10-BTBR-02）支持的。我们还感谢émergence-UPMC-2011研究计划的资助。

参考文献

Bisswanger，H.（2014）。酶学测定。 1：41- 55.
Gro?illier，A.，Herve，C.，Jeudy，A.，Rebuffet，E.，Pluchon，PF，Chevolot，Y.，Flament，D.，Geslin，C.，Morgado，IM，Power，D.，Branno， M.，Moreau，H.，Michel，G.，Boyen，C.and Czjzek，M。（2010）。 MARINE-EXPRESS：利用高通量克隆和表达策略进行海洋后基因组分析微生物细胞。 9：45。
Groisillier，A.，Labourel，A.，Michel，G.and Tonon，T。（2015）。海洋细菌Zobellia galactanivorans的甘露醇利用系统。 Appl Environ Microbiol 81（5）：1799-1812。