材料和试剂

注意：*这些材料/试剂可以替换为类似的替代品。

NUNC管-50ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：339651）*
全血（无菌）抗凝血剂（?50ml体积）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）
柠檬酸二钠二水合物（TNC）缓冲液（38克/升demi水，pH7.0）（Sigma-Aldrich，目录号：S1804）
Percoll （GE Healthcare，目录号：17-0891-09）
StemSpan TM SFEM（500ml）（STEMCELL technologies，目录号：09650）
脂质来自成年牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：L4646）的胆固醇*
青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）*
重组人干细胞因子（SCF）（Life technologies，目录号：PHC2115）*
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：PHC2115" />
重组人血小板生成素（TPO）（Life technologies，目录号：PHC9514）*
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：PHC9514" />
重组人红细胞生成素（EPO）（R& D Systems，目录号：287-TC-500）*
（可选）重组人Flt3-配体（FLT3-L）（Peprotech，目录号：30019）*
培养基（见配方）
1. 基本介质（参见配方）
2. 阶段I介质（膨胀）（参见配方）
3. 阶段II培养基（承诺）（参见配方）
4. III期培养基（分化）（见配方）

设备

注意：*指示的设备可以用类似的替代品替换。

Centrifuge-Rotanta 460（Hettich，目录号：5650）*
CASY细胞计数器（Roche，型号：CASY TTC）*

程序

从大约50ml全血开始，最近使用封闭系统（无菌）从健康供体或患者由训练的抽血者在同意下收集。建议在收集当天开始培养，但提取后1-2天也是可能的（尽管有供体变异）。我们通常使用柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖，但EDTA和肝素也与此方法兼容
在室温下以300×g（1000rpm）离心血液15分钟（使用制动器3）。
丢弃富血小板血浆（PRP）。通过移液收集白细胞环和一点红细胞层，并在PBS管中混合1：1 PBS/TNC缓冲液（图1）。
小心地在50ml的Nunc管中以25ml的比例在15ml Percoll（1.076g/ml）的顶部上小心地移动稀释的血红素环。在1,220×g /或2,400rpm（加速器3，制动器3，室温）下离心20分钟。
丢弃上层（等离子体），并采取位于Percoll层上方的血沉棕黄层（外周血单核细胞-PBMCs），避开红细胞下层（图1）。
通过加入1:1体积的PBS洗涤PBMC，并以475×g或1,500rpm离心5分钟，重悬于相同体积的PBS中。

图1.外周血单核细胞（PBMC）的分离。离心血液，用PBS/TNC以1:1稀释血沉棕黄层，如上所述加入到比例体积的Percoll中。离心后，基于密度分离不同的层，包括血浆（黄色），含有PBMC（紫色），Percoll（米色）和RBC和粒细胞（红色）的血沉棕黄层。仔细分离白血球层以进一步培养巨核细胞
使用单元计数器计数单元格。在I期培养基中重悬至1-2×10 6个细胞/ml的密度（优选地，最初在标准12孔培养板中生长细胞）。
每天观察细胞。健康的培养物的特征在于圆形，健康的7-10μm细胞，其在悬浮液或块中单独生长（参见图2B）。培养基应每2-3天更新（为此，收集细胞，在475×g下离心或在室温下以1,500rpm离心5分钟，并重新悬浮在新鲜培养基中）。一旦用新培养基更新培养物，将死细胞和细胞碎片洗出或稀释，这有助于培养物的福利。
如有必要，在第3-4天清洗/更新培养物，并在新鲜培养基中重新培养，或稀释在1/2体积的I期培养基中，这取决于细胞数量，其不应超过4×10 6/>细胞/ml
从第6-8天，可以在阶段II培养基中培养细胞。一般来说，第二阶段培养的持续时间不应超过4天
每天观察细胞。如果必要，在3天后洗涤培养物，并在新鲜培养基中重新培养，或者稀释在1/2体积的阶段II培养基中，取决于细胞数量。
从第9-12天，可以在III期培养基中培养细胞。阶段III的开始取决于阶段II期间的培养物发育，即培养物的福利，并且大多数细胞达到细胞直径> 13μm（见图2B和3B）。
在第13-14天或更早的时候，培养物中将出现更大的细胞，并且应该逐渐增加这些细胞的数量。每天观察培养物，因为取决于供体，一些巨核细胞将经历终末分化并开始形成前血小板，这意味着由于细胞死亡也丢失细胞。形态和生长受供体变异性的影响。据估计，从具有50×10 6个细胞的起始培养物中，平均有约50×10 6个巨核细胞，具有供体变异。这意味着培养首先扩增2-4倍，然后，仅25-50％的细胞成熟为巨核细胞。参见图2，关于通过流式细胞仪测量的形态学和表面标志物表达的培养物的动力学概述。

图2.PBMC衍生的巨核细胞培养物 A.流式细胞术分析。使用针对巨核细胞表面标志物的抗体混合物来区分人巨核细胞培养物中的分化阶段。这些标记通过成熟的表达描述如下。 B.细胞形态学。在明视野显微镜下观察细胞，并在培养的第8天，第12天和第16天拍摄照片
重要注意事项：
1. 虽然我们提出这种文化方法有优势文化并且从PBMC分化巨核细胞而不需要CD34 ⁺细胞选择，不言而喻，它也可以应用于分选的CD34 ⁺细胞（源自脐带血，骨髓或外周血）。
2. 在这期间可以冷冻培养物扩增期：如果需要，可以在第3天和第6天之间冷冻细胞。 ?细胞可以在胎牛或牛血清（FBS或10％DMSO）中的10％DMSO中冷冻 FCS）中并在-80℃下在冷冻容器中放置过夜以允许在将它们转移到液氮中之前逐渐降低温度 ?长期储存。解冻后，培养细胞几天阶段I，然后继续正常朝向阶段II和III。的文化将在这个冻结的阶段很快恢复并且增长将与原始文化非常相似细胞数目，形态和表达的MK特定表面标记如通过流式细胞术分析（图3）。

可选补充技术

材料和试剂

牛血清白蛋白-100G（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）*
用于流式细胞术分析的偶联抗体：
1. CD41a PerCP cy5.5（CD41）（BD Biosciences，目录号：333148）*
2. CD31太平洋蓝（CD31）（Biolegend，目录号：303114）*
3. cKIT PE-Cy7（KIT）（Biolegend，目录号：313212）*
4. CD42b APC（CD42b）（BD Biosciences，目录号：551061）*
5. CD71 FITC（CD71）（BD Biosciences，目录号：555536）*
6. CD61FITC（CD61）（Sanquin，目录号：M1592）*
7. CD49b PE（CD49b）（BD Biosciences，目录号：555669）*

设备

EasySep ^TM磁铁（STEMCELL Technologies）
流式细胞仪（LSRII + HTS）（BD Biosciences）*
荧光显微镜（Life Technologies，型号：EVOS FL成像系统）*
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，型号：EVOS FL成像系统"。注意：*这些试剂/设备可以用类似的替代品替换。

程序

图3.来自PBMC的巨核细胞培养变化 A.新鲜与相I-冷冻的PBMC衍生的巨核细胞培养物：流式细胞术分析。使用针对巨核细胞表面标志物的抗体混合物来区分人巨核细胞培养物中的分化阶段。来自两种条件（新鲜与第一阶段冷冻）的谱图看起来相似，并表明巨核细胞可以用这种培养方法成功地生长，这允许在培养的第一天期间冷冻培养物。IB阶段来自CD34的培养物的细胞形态⁺排序的细胞而不是PBMC。在明场显微镜下观察细胞并拍摄照片。来自培养的CD34 +分选的细胞的巨核细胞的形态类似于来自培养的总PBMC的巨核细胞的形态。

BSA梯度
1. 如果你需要收集一个更纯的部分巨核细胞（因为文化总是异质的），你可以做 ?BSA梯度以通过沉降收集较大的细胞并进行 ?与富集的馏分用于进一步分析
2. BSA梯度（0％，1.5％和3％）可以用于进一步分离相对较大的尺寸巨核细胞，如图4所示。如果细胞的量高于 1000万，在50ml管中用5ml体积进行BSA梯度。如果细胞数量低于10万，执行 BSA梯度在15ml管上，每层3ml体积
  
  图4.使用BSA梯度富集培养的巨核细胞。使来自III期培养基的细胞通过BSA沉淀梯度15-30分钟。巨核细胞将在底部沉淀并且可以 ?在PBS中收集
3. 让细胞沉淀15-30分钟在0 emg×g（未离心），使得巨核细胞在沉淀底部。
  用PBS收集巨核细胞，再次洗涤 ?在低速（100×g /或700rpm）下进一步进行下游分析
4. 或者，巨核细胞可以是通过磁分离（EasySep ^TM Magnet）检索 ?使用抗体（例如CD41-FITC）或通过FACS的阳性选择根据下游实验程序进行分选。
基于流式细胞术的巨核细胞分化
基本流式细胞术分析可以使用的混合物进行允许分析的分化阶段的抗体巨核细胞。图2-3显示了门控的示例策略，以及表面标记物的表达序列巨核细胞分化。

食谱

文化媒体
1. 基本介质
  StemSpan（500ml）
  富含胆固醇的脂质混合物（在500ml StemSpan培养基中加入2ml） 1％Pen/Strep
2. 阶段I介质（膨胀）
  基础培养基补充：
  SCF 100ng/ml
  TPO 30 ng/ml
  EPO 0.5U/ml
  FLT3-L 50 ng/ml（可选，尽管它有利于扩展）
3. 第二阶段媒介（承诺）
  基础培养基补充：
  SCF 50 ng/ml
  TPO 50 ng/ml
  EPO 0.5U/ml
  FLT3-L 25 ng/ml（可选，尽管它有利于扩展）
4. III期培养基（分化）
  基础培养基补充：
  TPO 100ng/ml

致谢

该方案改造自人类红细胞祖细胞上的先前培养方法（Borg等人，2010; Leberbauer等人，2005），并由VS，PP，和LG根据知情同意，经我们的研究所医学伦理委员会根据1964年赫尔辛基宣言批准后获得血样。

参考文献

Borg，J.，Papadopoulos，P.，Georgitsi，M.，Gutierrez，L.，Grech，G.，Fanis，P.，Phylactides，M.，Verkerk，AJ，van der Spek，PJ，Scerri，CA，Cassar ，W.，Galdies，R.，van Ijcken，W.，Ozgur，Z.，Gillemans，N.，Hou，J.，Bugeja，M.，Grosveld，FG，von Lindern，M.，Felice，AE，P??atrinos ，GP和Philipsen，S。（2010）。红细胞转录因子KLF1的半衰期导致胎儿血红蛋白的遗传性持续性。 Nat Genet 42（9）：801-805。
Eto，K.，Murphy，R.，Kerrigan，S.W.，Bertoni，A.，Stuhlmann，H.，Nakano，T.，Leavitt，A.D.and Shattil，S.J。（2002）。源自胚胎干细胞的巨核细胞在整合素信号传导中牵涉CalDAG-GEFI。 Proc Natl Acad Sci USA 99（20）：12819-12824。
Leberbauer，C.，Boulme，F.，Unfried，G.，Huber，J.，Beug，H。和Mullner，E.W。（2005）。不同类固醇共同调节原代人类红细胞祖细胞的长期扩增与终末分化。 Blood 105（1）：85-94。
Mazur，E.M.，Basilico，D.，Newton，J.L.，Cohen，J.L.，Charland，C.，Sohl，P.A.and Narendran，A。（1990）。从正常外周血祖细胞的液体培养物中分离大量富集的人巨核细胞。 Blood 76（9）：1771-1782。
Pick，M.，Azzola，L.，Osborne，E.，Stanley，E.G.and Elefanty，A.G。（2013）。在无饲养层和无血清培养基中从人胚胎干细胞产生巨核细胞祖细胞。 a> PLoS One 8（2）：e55530。
Sun，L.，Tan，P.，Yap，C.，Hwang，W.，Koh，L.P.，Lim，C.K.and Aw，S.E。（2004）。体外人脐带血衍生巨核细胞的生物学特征。 a> 33（5）：570-575。
Thornton，M.A。和Poncz，M。（1999）。体外扩增来自外周血造血祖细胞的巨核细胞。 Methods Mol Med 31：337-345
Tolhurst，G.，Carter，R.N.，Miller，N.和Mahaut-Smith，M.P。（2012）。纯化天然骨髓巨核细胞用于基因表达研究方法Mol Biol 788：259-273。