材料和试剂

大肠杆菌 K12细胞
蒸馏无菌水（dH 2 O）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：24201-1L-R）
<氯仿（CHCl 3）（VWR International，目录号：22711.290）
三氯乙酸（TCA）（Sigma-Aldrich，目录号：27242-500G-R）
乙醇（EtOH）（100％）（Sigma-Aldrich，目录号：24103-5L-R）注意：产品24103已停用。
三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Trizma碱）（Sigma-Aldrich，目录号：337411KG）
1 M KH 2 PO 4（Merck Millipore Corporation，目录号：A148973）
< 1M磷酸氢二钾K 2 HPO 4（Fluka，目录号：60353）
注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，目录号：60353"。
十二烷基硫酸钠20％SDS 20％（生物溶剂化学品，目录号：19812323）
尿素（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：66612）
< NaOH（Merck Millipore Corporation，目录号：21778425）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：114391）
甘油（VWR International，目录号：24388.295）
Parafilm（Thomas Scientific，Pichiney Plastic Packaging，目录号：PM-992）
50 mM磷酸盐缓冲液（PB）（pH 7.0）（请参阅配方）
250mM乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SS）（参见配方）
0.3 M（2-磺酸基乙基）甲烷硫代磺酸钠（MTSES）（Anatrace，目录号：S110MT）（参见配方）
1 M L-半胱氨酸（IGN，目录号：194646）（请参阅配方）
注意：目前，它是"mpbio，目录号：194646"。
甲醇（MeOH）（95％）（Sigma-Aldrich，目录号：32213-1L）（参见配方）
1 M Tris-HCl（请参阅配方）
变性缓冲区（请参阅配方）
PEG缓冲液（见配方）
> 1.2mM甲氧基聚乙二醇5000马来酰亚胺（malPEG）（Sigma-Aldrich，目录号：63187）（参见配方）
羟胺溶液（HA）（Sigma-Aldrich，目录号：59417）（参见配方）
1M Tris.HCl，1％SDS（参见配方）
SDS-样品缓冲液（参见配方）
DL二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）（参见配方）

设备

孵育器（37℃）（Infors AG）
分光光度计（600nm）（Eppendorf，型号：Biophotometer plus）
台式离心机（Eppendorf，型号：5472R/5427R）
电泳装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Miniprotean II）
Western印迹装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Transblot Turbo）
Vortex Genie 2（科学工业）

程序

我。使用硫醇特异性和烷基化试剂的半胱氨酸残基的可及性

离心2×1ml细胞培养物1分钟。在16,100×g 在台式离心机。洗涤细胞在1ml PB。
离心细胞。重悬细胞沉淀在0.24毫升PB缓冲液中，加入 ?10μl25mM EDTA（1mM终浓度）。在步骤C中直接使用单元格。
注意：EDTA处理渗透外膜。
对于每个样品，等分120μl到用（+）和没有（ - ）MTSES标记的微量离心管中。

MTSES保护
注意：在暴露于MTSES时，尽可能轻柔地处理样品。 EDTA 透化外膜，但细胞质膜需要完好无损。加入L-半胱氨酸淬灭反应后，样品可以更粗略地对待。清洗步骤是除去L-半胱氨酸。

加入13μl0.3 M MTSES（最终30 mM）到管标记（+）MTSES
小心地向上和向下移液，向试管标记的（ - ）MTSES中加入13μldH 2 O。
在室温下孵育30分钟。
通过小心地向上和向下移液，向两个管中加入14μl1μML-半胱氨酸（终浓度100mM）
在室温下孵育10分钟。
加入0.75ml PB。
在台式离心机中以16,100×g离心5分钟。
用0.5 ml PB洗涤细胞2次。
重悬细胞在50微升PB。

用甲醇/氯仿进行样品变性
注意：预先冷却的台式离心机至4°C。

加入750μl变性缓冲液。
剧烈涡旋，在4℃孵育30分钟
旋转16,100 x g 3分钟。
用移液管去除上清液非常仔细和完全。通常不需要另外的离心步骤。
加入400μl95％MeOH
旋转16,100 x g 4分钟。
小心地除去上清液，并在室温下风干颗粒15分钟注意：不要翻转管，球团松动。

用malPEG烷基化
注意：将带有malPEG的瓶子带到室温并制备malPEG 溶液，防光。将malPEG粉末放回-20°C后包装有石蜡膜的瓶子。

在冰上冷却100％EtOH
将每个空气干燥的沉淀重悬于100μlPEG缓冲液中，涡旋
每管加入20μlmalPEG，并通过上下吹打小心混合
在室温下在暗处孵育30分钟。
加入1.5ml冰冷的100％EtOH，在-20℃下冷冻1小时注意：样品可以在-20°C过夜。

SDS-PAGE和Western印迹注意：开始之前，预先冷却台式离心机。

颗粒样品15分钟。在桌面离心机中为16,100 x g
小心地清除大部分上清液。
重新离心样品，并将所有剩余的液体
空气干燥颗粒注意：不要颠倒管，药丸是松散的。
将样品重悬于含有4mM DTT的SDS-PAGE样品缓冲液中
在100℃加热5分钟
在样品制备时使用A <600>测量在凝胶上加载当量
加载每个 -/+对彼此相邻。
运行凝胶和Western印迹。

II。硫酯键断裂后半胱氨酸对烷基化剂的可接近性

按照A中所述的协议

HA治疗
1. 在台式离心机中以16,100×g离心1.6ml细胞培养物1分钟。
2. 将细胞重悬在1ml PB中。
3. 在标记有 - 和+ HA和离心细胞的管中分开2×500μl
4. 通过向上和向下移液，将细胞重悬在500μl1M Tris-HCl（pH 7.0），1％SDS（ - ）或500μl1M HA（pH 7.4），1％SDS 注意：这会使蛋白质变性，并在一个步骤中裂解硫酯键。
5. 在室温下孵育30分钟。
6. 加入50μl100％TCA，涡旋
7. 在冰上孵育30分钟。预冷台式离心机
8. 在4℃下在16,100×g离心15分钟蛋白质沉淀
9. 用1ml冰冷的丙酮（储存在-20°C）洗涤沉淀3次，每次以16,100×g离心10分钟。
10. 空气干燥颗粒。按照E和F中的步骤操作。
  注意：TCA丸粒通常难以溶解。严谨，频繁地涡旋。

代表数据

图1.Ep的载脂蛋白N-酰基转移酶（Lnt）的malPEG烷基化谱的实施例。大肠杆菌。半胱氨酸残基23和62被丙氨酸取代，留下单个活性位点半胱氨酸残基C387。 Lnt通过C387在体内形成硫酯酰基 - 酶中间体，并且被阻断用于与malPEG的反应。在用羟胺（HA）处理细胞时，硫酯键被切割，留下C387的游离硫醇基并通过malPEG烷基化。有代表性的例子，请参见Gélis-Jeanvoine 等人（2015）。

笔记

结果可能根据所研究的膜蛋白而变化。强烈建议包括阴性和阳性对照以验证手术的技术细节。例如，推荐使用空载体，目的蛋白的无半胱氨酸变体和具有取代的半胱氨酸残基的无活性突变体。

食谱

磷酸盐缓冲液（PB）（50mM，pH 7.0）
制备100毫升1M KH 2 PO 4 4/
制备100毫升1M K 2 HPO 4
将1.5375ml K 2 HPO 4与0.9625ml KH 2 PO 4 PO 4混合，并将蒸馏的无菌水加入到50ml
最终浓度为50mM KPi（pH 7.0）
0.25 M EDTA
将93.05g EDTA加入到800ml H 2 O中用NaOH调节pH至8.0 注意：EDTA二钠不溶于溶液，直到pH约为8.0。
分成等份和高压灭菌
MTSES溶液（使用前清新）
对于每个36.3mg，加入500μlH 2 O，最终浓度为0.3M/dm 2
1μML-半胱氨酸在1ml H 2 O中的121mg L-半胱氨酸
95％MeOH
向47.5ml MeOH中加入H 2 O至50ml
1M Tris。 HCl
将121.1g Trisma碱加入到800ml H 2 O中，用HCl调节pH至7.0 将H <2> 添加到1L的最终体积中。
高压灭菌器
变性缓冲液（使用前清新）
为了获得H 2 O:MeOH:CHCl 3 = 1:4:1的溶液，加入到15ml Falcon管中：
2ml H 2 O 2 / 8ml MeOH
2ml CHCl 3/
PEG缓冲液
含有10M尿素，1％SDS，1mM EDTA的1M Tris pH7.0。
每ml溶液：
0.6克尿素
0.01克SDS
溶解在600μl1M Tris（pH7.0）中，需要混合并浸在温水中
制备后不要将溶液放在冰上，因为尿素会沉淀
加入4μl0.25M EDTA
用1M Tris（pH 7.0）将体积调节至1 ml，
注意：PEG缓冲液含有尿素，SDS和EDTA，可使所有蛋白质变性，并使所有未受保护的半胱氨酸残基进入malPEG。
malPEG溶液
注意：使用前请清新，不能储存。
允许malPEG达到室温
称量少量，约5 mg，在称量纸上
添加H 2 O以达到1.2mM的最终浓度MalPEG：对于1mg的malPEG，添加170μl的H 2 O 2。
注意：对于每个样品，需要10μl的1.2mM malPEG，其对应于12nmol malPEG。 1nmol malPEG为5μg。准确称量的malPEG的最小量为4-5mg。这足以容纳34个样本。
羟胺溶液（HA）
将1.4g HA溶解在10ml冷H 2 O中，制成20ml最终的HA溶液。
用32％NaOH将pH调节至7.4，如下
加入1.5ml 32％NaOH，搅拌并检查pH值
逐渐加入更多的NaOH，并检查pH，直到pH为7.4 用H 2 O将体积加至20ml 注意：pH值应在6.9和7.5之间，在pH8.5左右，溶液的特异性会降低。
1M Tris缓冲液，1％SDS洗涤加20％SDS至1M Tris溶液至终浓度为1％
SDS-样品缓冲液（4x）
2.5ml 1M Tris（pH 6.8）
1.0克SDS
4ml 100％甘油 0.8ml 0.1％溴酚蓝
0.16ml 1M DTT
用dH 2 O
1 M DTT
将1.5g DTT溶解在8ml H 2 O中，将体积调节至10ml
分成1ml等分试样，并储存在-20℃下

致谢

这项工作由巴斯德研究所资助。

参考文献

Bogdanov，M.，Zhang，W.，Xie，J.and Dowhan，W。（2005）。通过取代的半胱氨酸可接近性方法（SCAM TM）的跨膜蛋白质拓扑学绘图：应用于脂质 - 特异性膜蛋白质形成。方法 36（2）：148-171
Gélis-Jeanvoine，S.，Lory，S.，Oberto，J.and Buddelmeijer，N.（2015）。位于膜嵌入的柔性环上的残基对于载脂蛋白N-酰基转移酶反应的第二步是必需的。 Mol Microbiol 95（4）：692-705。