材料和试剂

胶原I型包被的板（在包被后通过UV灭菌过夜）（用于包被板的方案由Sigma-Aldrich在相关产品信息中提供）
在无菌条件下的生原细胞（分别参见Chen等人，2014和Gharaibeh等人，2008）用于原代人和小鼠细胞分离）
注意：对于小鼠细胞，可以使用C2C12细胞系（ATCC，目录号：CRL-1772）作为阳性对照。
DMEM高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：11995）
胎牛血清（FBS）（Invitrogen，目录号：10437-028）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：10437-028"
马血清（HS）（Invitrogen，目录号：26050-088）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：26050-088"。
鸡胚提取物（CEE）（Accurate Chemical& Scientific Corporation，MD-004-D）
青霉素 - 链霉素（P/S）（Invitrogen，目录号：15140-122）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：15140-122"。
在小鼠（1:100）（Sigma-Aldrich，目录号：D1033），小鼠抗Fast-MyHC（1:250）（Sigma-Aldrich，目录号：M4276）或单克隆抗肌球蛋白（1：250）（Sigma-Aldrich，目录号：M8421）中产生的（骨骼，慢）抗体
正常驴血清（Jackson Immuno Research，目录号：017-000-121）
Alexa 594-缀合的抗小鼠IgG抗体（1:500）（Invitrogen，Molecular Probes，目录号：A-21203）或Alexa 488-缀合的抗小鼠IgG抗体（1:500）（Invitrogen，Molecular Probes，：A-21202）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM ，目录号：A-21203和A-21202"。
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（100ng/ml，用来自原种的DPBS稀释）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
小鼠鼠标（M.O.M）基本试剂盒（染色试剂盒）（Vector Labs，目录号：BMK-2202）
来自小牛皮肤（非无菌）的胶原（Sigma-Aldrich，目录号：C9791）
不含钙和镁的Dulbecco's DPBS（DPBS）（Invitrogen，目录号：14190-250）
注意：目前，是"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：A-21203和A-21202。
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：270725）
福尔马林（10％）（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128）
胰蛋白酶-EDTA（1x，用无菌DPBS稀释的10x储备液，无酚红）（Invitrogen，目录号：15400-054）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM 目录号：15400-054" br />
胶原I型（Sigma-Aldrich，目录号：C9791）
肌肉增殖培养基（见配方）
肌肉融合培养基（见配方）

设备

细胞培养箱
荧光显微镜

程序

骨骼肌原始激活
1. 对于非天然地致力于骨骼肌形成的细胞（例如，从非肌肉器官分离的细胞），启动步骤可以促进肌原性分化体外。
2. 以引发感兴趣的细胞对于骨骼肌形成，将细胞接种在包被I型胶原上平板以低密度（2×10 3个细胞/cm 2 ）与肌肉一起培养5-7天增殖培养基
3. 中度应每2天完全更换一次。
4. 为了进一步提高它们的生肌效率，通过细胞在37℃下典型的胰蛋白酶消化5分钟，然后重复启动步骤一次或多次。
骨骼肌分化
1. 对于人细胞，将细胞接种在胶原I型包被的24-或对于7-14的高汇合（> 2.5×10 4个细胞/cm 2 ）的48-孔板天用人类肌肉融合（肌原性）培养基：DMEM高葡萄糖补充有1％FBS，1％HS，0.5％CEE和1％P/S。
2. 一半融合培养基每2-3天更新一次，直到伸长，多核骨骼肌纤维出现（Crisan等人，2008）。
3. 对于小鼠细胞，接近或处于汇合（> 1.5×10 4细胞/cm 2）的细胞，在小鼠肌肉融合（生肌）培养基：DMEM中培养3-7天 ?高葡萄糖补充有2％FBS和1％P/S。
4. 一半融合培养基每2天更新一次，直到伸长，多核骨骼肌纤维出现（Lu等人。，2014）。
5. 对于人和鼠标 ?细胞不耐受突变转为低血清融合培养基可导致细胞死亡，可逐渐诱导骨骼肌形成降低血清浓度从20％降至2％（例如，20％-10％-5％-2％ ?每个阶段3-7天），直到伸长的多核骨骼肌纤维出现。
6. 阳性肌细胞对照（例如骨骼肌成肌细胞）可以包括在实验中，其中细胞感兴趣以确认肌原性培养基的功效。
骨骼肌纤维检测
1. 骨骼肌分化可以首先通过鉴定细长的多核骨骼肌纤维的不同形态（图1）。
2. 为了精确确定生肌分化，免疫荧光染色的肌细胞标记：结蛋白（早期肌细胞增生），快和慢肌球蛋白重链（快和慢-MyHC; 成熟肌发生）。
3. 对于人类细胞，7-14天在肌肉融合培养基中培养后，将细胞漂洗两次 DPBS，然后在冷甲醇/丙酮混合物（1：1，-20）中固定5分钟 ?°C）（Chen等人，2015）。
4. 对于小鼠细胞，3-7天后在肌肉融合培养基中培养，用DPBS漂洗细胞两次然后在冷甲醇（-20℃）中固定5分钟（Lu等人，2014）。
5. 或者，可以在室温（RT）下用10％福尔马林固定细胞8分钟（Sohn等人，2015）。
6. 用DPBS洗涤3次，每次5分钟后，固定细胞用10％正常驴血清封闭1-2小时，然后孵育，无需洗涤，用原代小鼠抗结蛋白，小鼠抗Fast-MyHC或小鼠抗 - 慢-MyHC抗体（稀释于5％正常驴血清）在室温或4℃过夜2小时。
7. 洗后3 ?用DPBS洗涤5次，每次5分钟，然后将细胞与二抗Alexa 594缀合的抗小鼠IgG抗体或Alexa 488-缀合的抗小鼠IgG抗体（用5％正常驴稀释血清）在室温下孵育30分钟至1小时。
8. 用DPBS洗涤3次，每次5分钟后，通过DAPI将细胞核染色5分钟。
9. 用DPBS洗涤2次，每次5分钟后，用荧光显微镜观察染色的细胞
10. 分化的肌管的百分比可以量化为 MyHC阳性肌管中的核数相对于总数的核。
11. 染色的细胞可以在无菌DPBS中于4℃在黑暗中保存长达1周。
12. 如果染色背景在洗涤后仍然存在，第一抗体 ?可以使用小鼠 - 小鼠（M.O.M）染色试剂盒进行检测以减少信号噪声，根据制造商的说明。

代表数据

图1.代表性数据。肌肉性诱导7天后，人类多核心骨骼肌形成的代表性图片。

笔记

我们观察到早期和晚期传代细胞之间骨骼肌形成的变异性。早期传代细胞一般具有较高的骨骼肌形成（有或没有引发）
该方案不适用于在高血清浓度的高葡萄糖DMEM中不能增殖至接近汇合的细胞。

食谱

肌肉增殖培养基
（FBS），10％马血清（HS），1％鸡胚胎提取物（CEE）和1％青霉素 - 链霉素（P/S）的DMEM高葡萄糖中，然后切换到肌肉融合培养基Chen 等人，2015）
肌肉融合介质
人类肌肉融合培养基：补充有1％FBS，1％HS，0.5％CEE和1％P/S的DMEM高葡萄糖（Chen等人，2015）小鼠肌肉融合培养基：补充有2％FBS和1％P/S的DMEM高葡萄糖（Lu等人，2014）

致谢

该协议改编自Chen等人（2015）的修改。这项工作是由医学研究委员会（B.P.），英国心脏基金会（B.P.），国家卫生研究所（R21HL083057到B.P。）的赠款支持。

参考文献

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Chen，W. C.，Saparov，A.，Corselli，M.，Crisan，M.，Zheng，B.，Péault，B。和Huard，J.（2014）。从人类骨骼肌中分离血管来源的多潜能前体。 J Vis Exp （90）：e51195。
Cris，M.，Yap，S.，Casteilla，L.，Chen，CW，Corselli，M.，Park，TS，Andriolo，G.，Sun，B.，Zheng，B.，Zhang，L.，Norotte， C.，Teng，PN，Traas，J.，Schugar，R.，Deasy，BM，Badylak，S.，Buhring，HJ，Giacobino，JP，Lazzari，L.，Huard，J。和Péault，）。多种人体器官中的间充质干细胞的血管周围起源细胞干单元格 3（3）：301-313。
Gharaibeh，B.，Lu，A.，Tebbets，J.，Zheng，B.，Feduska，J.，Crisan，M.，Péault，B.，Cummins，J.and Huard，J。（2008）。通过preplate技术分离含有来自鼠骨骼肌的干细胞的缓慢粘附的细胞级分。 a> Nat Protoc 3（9）：1501-1509。
Lu，A.，Poddar，M.，Tang，Y.，Proto，J. D.，Sohn，J.，Mu，X.，Oyster，N.，Wang，B.and Huard，J.（2014）。营养不良mdx/utrophin -/- 小鼠中肌肉祖细胞的快速消耗 em> Hum Mol Genet 23（18）：4786-4800。
Sohn，J.，Lu，A.，Tang，Y.，Wang，B.and Huard，J.（2015）。营养不良性肌营养不良蛋白/utrophin基因敲除小鼠在疾病进展期间激活非肌源性间充质干细胞。/a> Hum Mol Genet 24（13）：3814-3829。