材料和试剂

培养皿
< em> Vallisneria植物
注意：20-30厘米长的Vallisneria的幼苗在热带鱼店购买，并在装有自来水和底部一层土壤的桶（20L）中培养（图1C）。植物在12-24小时光照/12小时黑暗条件下在20-24℃生长。
凡士林（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：224-00165）
氯化钾（KCl）（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：163-03545）
氯化钠（NaCl）（Nacalai tesque，目录号：31320-05）
硝酸钙四水合物[Ca（NO 3）2]（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：039-00735）
硝酸镁六水合物[Mg（NO 3）2]（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：134-00255）
PIPES（DOJINDO，目录号：345-02225）
氢氧化钠（NaOH）（Wako Pure Chemical Industries，Siyaku，目录号：197-02125）
人工池水（APW）（参见配方）
100x APW混合物（参见配方）
200 mM PIPES-NaOH（参见配方）

设备

荧光灯（国家，型号：FL20S-PG）
真空泵（ULVAC KIKO，型号：DTU-20）
显微镜（OLYMPUS，型号：BX50）
中性密度过滤器（Fujifilm Corporation）
干涉滤波器（东芝，型号：KL-55）
截止滤波器（东芝，型号：O-54）
量子传感器（LI-COR Biosciences，型号：LI-190SA）
数据记录器（LI-COR Biosciences，型号：LI-1400）
电荷耦合器件相机（QImaging，型号：RETIGA 2000RV）

程序

植物材料和标本的预处理
1. 在a。处购买20-30cm长的
2. 在......的最后 ?光照期，健康叶片段10厘米长采取30之间并且距离生长超过100cm的枝条的根部40cm ?成为长度约4mm的小块并放入人工池塘水（APW）。
3. 被截留在细胞间隙中的空气 ?使用与旋转真空泵连接的干燥器抽空20小时 ?min。
4. 每个4mm长的叶片进一步切开分成近轴一半和下半轴（图2A; Sakurai等人， ?2005）。
5. 将每个近轴半部浮在与之分开的容器中新鲜APW并保持在12小时光照/12小时黑暗状态的另一个循环下。
6. 将叶片用盖玻片安装在载玻片上 ?表皮细胞可以从上面看到，并用白色固定凡士林（图2B）。
7. 将每个样品浸入新鲜APW中 ?培养皿（图2B）并保持在来自荧光灯的弱白光（2μmolm -2 s -1 s -1）下6小时。他们进一步保持完全黑暗另外12-20小时。
用于观察叶绿体运动的延时光学显微镜
1. 用蓝光（488nm，80μm）照射暗适应样品 μmolm < - s ^{s ^-1）在显微镜的台上从上方通过物镜，使用具有二向色镜的落射照明系统 ?和汞灯（图2C）。蓝光的流量率为使用中性密度滤光片手动调整。}
2. 样品是用浅绿色光（550nm，10μmolm -2 s -1 s -1 -1 ）观察到，其通过组合干扰滤波器（最大透射率为35％）和根据Izutani等人（1990）从下面应用的截止滤光片。虽然许多植物光感受器已知吸收绿色光区域，我们证实在这个能量密度下550nm的光几乎没有影响Vallisneria中的叶绿体运动和细胞质运动（Izutani等人，1990; Takagi等人，2003）。
  注意：流量率的单色光用量子传感器和数据记录仪测量。
3. 之前 ?并且在光化性蓝光照射期间，光学图像使用电荷耦合器件相机以5秒数字捕获间隔（图2C）。
  
  图3.叶绿体的观察 A.准备近轴叶片的方案。双头箭头;叶的纵轴。阴影平面;切割平面使叶片的近轴和下半部。 B.准备 ?样本在暗适应之前。 APW;人工池塘水。 C。光学系统。 BL;蓝光（488nm，80μmolm -2 s -1 s -1），GL;绿色光（550nm，10μmolm -2 s -1 s -1），ND;中性密度，CCD; 电荷耦合器件，PC;个人电脑。 D.序列图像的表皮细胞以1分钟间隔排列。在0分钟时，细胞是暴露于蓝光。柱：10μm
4. 数字和位置 ?记录每个数字图像上的叶绿体用于运动分析。 ?一系列数字图像也可以组合成电影（视频 1）。
  
  视频1.在Vallisneria中避免叶绿体运动。一系列5秒间隔的图像，1分钟前和19分钟将蓝光照射堆叠成电影（每秒12帧）。 ?电影中的明亮闪光表示开始照射。酒吧; 10 μm
5. 必要时，在开始观察之前，标本用含有各种化学品的APW灌注，例如，光合电子传递的抑制剂，细胞骨架破坏 ?试剂和细胞内钙瞬变抑制剂。一切程序在浅绿色光（0.03μmolm -2 -2 s -1 s -1）下进行。

笔记

食谱

人工池水（APW）
APW可以大量制备并在室温下储存。
要准备10升APW，混合
100 ml 100x APW混合物
100ml 200mM PIPES-NaOH（pH7.0） 800ml去离子水
100x APW混合物
100x APW可以在4℃下储存。
为了制备1L的100×APW混合物，混合
3.73g KCl（最终浓度50mM） 1.17g NaCl（终浓度20mM） 1.64g Ca（NO 3）2（最终浓度10mM）
1.48g Mg（NO 3）2（最终浓度为10mM）
200mM PIPES-NaOH（pH7.0） 60.48g溶于1L去离子水中的PIPES，用NaOH调节至pH7.0 它可以存储在4°C。

致谢

我们感谢Motoyuki Iida先生拍摄Vallisneria植物的培养设施的照片（图1C）。

参考文献

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