材料和试剂

细胞过滤器（400目）
离心管（1.5ml和10ml）（Corning Inc.，目录号：MC-150-C）
圆形培养皿（直径35mm）（Corning Inc.）
方形培养皿（100mm，pym-100-10）（Xinshengke）
塑料条
构造的向量（Li ，，2015）
转基因分泌物24（OsSEC24）（Li等人，2015）水稻幼苗和质膜（PM）ATP酶2（OsPMA2）-mCherry（Li等人，2015 ）加OsSEC24-GFP双转基因水稻原生质体
纤维素酶（Onozuka，目录号：130419-01）
Macerozyme（日本）（目录号：121207-01）
M519（目录号：14C0519105B）
甘露醇
MES（pH 5.7）
KCl
NaCl
CaCl <2>
MgCl 2
蔗糖
1％-1.5％琼脂
NMT的校准介质缓冲液（pH 7.0）（参见配方）
NMT的校准介质缓冲液（pH 5.0）（参见配方）
孵化解决方案（参见配方）
Mmg解决方案（参见配方）
MS介质（参见配方）
NT介质（见配方）
原生质酶溶液（参见配方）
聚乙二醇（PEG） - 钙溶液（参见配方）
用于NMT的标准培养基缓冲液（pH 6.0）（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）

设备

离心机（SIGMA Laborzentrifugen GmbH，型号：3K15）
玻璃烧杯（100ml）（Bomex）
生长室
液体离子交换器（LIX）支架（YoungerChina）
微电极（1-2μm，4-5μm）（YoungerUSA）
微量移液器（100-1,000μl和10-100μl）（Eppendorf）
非侵入式微测试系统（YoungerUSA，型号：NMT100系列）
Shaker（Focus Technology Co.，Shanghai Meditry Instrument，型号：THZ-C-1）

软件

NIS-Elements AR软件（可从 http://www.youngerusa.com 获得）
ASET 2.0软件（imFlux ^?软件）（可从 http://www.youngerusa.com获取）
JCal v3.2.1（可在 http://www.youngerusa.com 查看）

程序

转基因水稻根系系统的测量
1. 转基因水稻幼苗的培养十四天的转基因转化的水稻（'Oryza sativa L.'Japonica' pCAMBIA1302-OsSEC24-GFP在受控的MS培养基上发芽在28摄氏度（℃）下16小时光照/8小时黑暗循环中的条件。 ?分泌24（OsSEC24）是外壳蛋白II（OsCOPII）的组分，囊泡是分泌蛋白分选所必需的，包括质膜（PM）ATP酶2（OsPMA2）。关于 OsSec24 的更多信息可以在Li 等（2015）中找到。
2. 无创测量
  1. 微电极的准备和校准
    1. 使用氯化银装置用100mM KCl将银氯化20秒，如图1所示。
      
      图1.氯化银装置的示意图。银色连接到电池的正电极和铂丝连接到电池的负极。
    2. 用0.5cm H +液体离子交换剂（LIX）和1-1.5cm NaCl/K 2 HPO 4缓冲液填充保持器和微电极。
    3. 将支架和微电极放在显微镜镜头下 ?用15-25μmH ⁺ LIX填充微电极的尖端，如下所示 ?和图2和图7中
      
      图2.位置的示意图微电极和LIX夹。微电极（右）和LIX支架（左）在显微镜的同一个领域。图片来自 YoungerUSA（徐岳，北京）NMT服务中心。
    4. 安装将微电极进入非侵入性微测试装置并手动将微电极放置在就绪位置，如图3所示。
      
      图3.微电极和非侵入性的连接图微测试装置。准备的微电极插入设备。图片来自YoungerUSA（Xuyue，北京）NMT 服务中心。
    5. 校准每个离子特异性微电极在每次实验之前和之后用一组已知的pH缓冲液 ASET 2.0软件防止电极漂移（图4）。单击技术按钮，确保在校准前将ISP/PVP设置为X-30，将dx设置为30μm。单击技术按钮并选择校准，在溶液1和0.01 in的空间中输入0.0001 溶液2.将参比电极和微电极放入标准介质缓冲并确保整个参考提示电极和微电极浸没在标准介质缓冲液中。 ?在校准培养基（pH 7.0和pH 7.4）中校准质子（H + +） ?pH 5.0），分别通过点击溶液1和溶液2按钮，遵循相同的程序和标准（图7）。仅使用具有介于53和63 mV/decade之间的能斯特斜率的H ⁺电极测量。如果校准不正确，则必须丢弃数据。
      
      图4. ASET 2.0软件中电极校准的界面。图片来自YoungerUSA（北京徐越）NMT服务中央。
测量转基因水稻苗的根毛中的H ⁺通量
1. 在标准培养基缓冲液中在室温下洗涤和温育转基因水稻根5分钟
2. 使用塑料条将标准培养基缓冲液置于培养皿中的整个转基因水稻根（图5）
  
  图5.如何放置整个转基因水稻根的示意图
3. 查看根毛和微电极在高放大倍率（40x）用Zeiss复合显微镜通过使用NIS-Elements AR软件 ?和位置如图8C所示。
4. 位置微电极接近属于侧生的成熟区域的根毛根，如图8C所示。单击模式按钮，然后选择观看，然后单击"记录并恢复"按钮启动计算机测量。在两个偏移点处测量微伏差借助于NIS元件操作的0.05赫兹（Hz）的频率 AR和ASET 2.0软件，如图6所示。两者之间的距离偏移点（dx）为30微米（μm）。监测每根根毛附近的净H ^{+ 通量的动力学15分钟。两个根每个水稻幼苗和测定每个根的两根根毛
  
  图6. 观看模式在ASET 2.0软件中。图片来自Younger USA （徐岳，北京）NMT服务中心。}
5. 微伏差异在通过使用转换为净H ⁺通量之前被导出为原始数据 JCal v3.2.1。选择H ⁺测量，dr等于使用的dx，和 ?输入校准期间测量的斜率和截距。最后，输入数据Origin（1）毫伏（mV）和AvgOrigin-X微伏（μV） ?如通过ASET 2.0软件（The imFlux Software）所测量。 H ⁺通量 ?使用JCal v3.2.1软件直接计算。积极数字表示H ⁺的流出，而负数表示 ?H ⁺的流入。每组转基因水稻的H ^{+通量测定根毛由四个独立的重复组成（图8）
  
  图7. H ⁺通量检测示意图。微电极尖端 ?充满H sup + LIX和NaCl/K 2 HPO 4缓冲液。氯化银（Ag/AgCl）浸没在NaCl/K 2 HPO 4缓冲液中。电压梯度（dV = ?通过静电计在两个位置之间测量静电电势（V 1 -v 2 -v 1） ?行程范围（dx）。使用以下公式计算浓度梯度（dc） dV。 D，H ⁺扩散常数; J，H ⁺的净离子通量
  
  图8。通过使用NMT测量水稻根毛中的H + +/+外流（Li等人， 2015）。结果表明OsSEC24对H ⁺挤出的影响转基因水稻根系在-Fe条件下。 A. H ⁺ flux in的动力学 OsSEC24转基因（左）和野生型（WT）（右）水稻根毛在-Fe或+ Fe培养基上生长两周。 B. H ^{+ 通量的平均速率在（A）中，使用四次独立测量的平均值（平均值± SE）。每个植物中有两个根，每个根中有两个根毛测定。 **表示p < 0.01使用Student's t 测试。（C）测量位置在NMT期间使用H ^{+选择性微电极。}}}
在转化的水稻原生质体中的测量
1. 水稻细胞悬浮培养
  孵育水稻（水稻 L.cv。 Japonica）细胞（在这种情况下，由遗传学研究所和 ?中国科学院开发）暂停在NT培养基中在28℃下以150转/分钟（rpm）在黑暗下5天条件。
2. 水稻原生质体的制备和瞬时转化从水稻悬浮细胞进行原生质体分离和类似于Li等的瞬时表达（2015）。
  1. 水稻原生质体的制备
    1. 收获稻悬浮细胞进入离心管，并允许静置15分钟，然后丢弃NT介质。
    2. 孵育水稻细胞在原生质体酶溶液中1-2小时 ?在26℃下在轨道振荡器中以50-75rpm温和搅拌
    3. 将未消化的材料中的原生质体分离成玻璃烧杯用细胞过滤器并在4℃下以2,000rpm离心15分钟 C。
    4. 将细胞重悬于5ml洗涤缓冲液中，然后通过在4℃下以2,000rpm离心15分钟进行沉淀。
  2. 水稻原生质体的瞬时转化
    1. 在室温下重悬于0.3ml的Mmg溶液中加入0.03ml质粒，包括pBIN20- OsPMA2-mcherry 和 pBI221-OsSEC24-GFP和0.33ml PEG-钙溶液。
    2. 孵育原生质体在室温下15分钟在黑暗中进行转化。
    3. 洗涤转基因原生质体用0.3毫升的洗涤缓冲液和在26℃下在2,000rpm下离心15分钟，然后温和再悬浮在培养皿中的1ml孵育溶液中并在室温下孵育温度20-25小时。
    4. 质子分泌是由介导的 ?细胞通过质膜（PM）到环??境并且通常由植物中的H sup +ΔP酶进行。 OsPMA2是水稻PM-H sup + +/-ATPase 通过水泡贩运排序到PM。更多信息关于 Ospma2 的文章在Li 等人（2015）中提供。
3. 无创测量
  1. 微电极的准备和校准
    要准备和校准微电极，请按照说明进行操作在上面的部分A2a中给出，改变步骤A2a-v，使得ISP/PVP被设置为 ?X-10。
  2. 测量转基因水稻苗的根毛中的H ⁺通量
    1. 将转化的原生质体放在带有标准培养基缓冲液的培养皿中，并在室温下孵育5分钟
    2. 在高处观察转化的原生质体和微电极放大（40x）用Zeiss复合显微镜使用 NIS-Elements AR软件，如图9C所示定位。
    3. 位置微电极接近三个相等大小的转换原生质体，如图9C所示。按模式按钮并选择观看ASET 2.0软件（imFlux ^?软件）。按记录和恢复按钮启动计算机测量。微伏差异在两个偏移点以0.05Hz的频率测量借助于NIS-Elements AR和ASET 2.0软件（The imFlux ^?软件）。两个偏移点（dx）之间的距离为 ?10μm。监测每个原生质体附近的净H ^{+ 通量的动力学 15分钟。}
    4. 使用JCal v3.2.1输出原始微伏差异并转换成净H ⁺通量。选择测量的H ⁺，dr等于 ?dx，并输入校准期间测量的斜率和截距。最后，粘贴Origin（1）毫伏（mV）和AvgOrigin-X的值 μV，通过ASET 2.0软件（the imFlux Software）测量。 H ⁺通量由JCal v3.2.1软件直接计算。一个正数表示H ⁺流出，而负数表示H ⁺流入。每种类型的转化原生质体的H sup +通量测定由三次独立重复（图3）
      
      图9.测量使用NMT（Li等人，2015）在转化的水稻原生质体中表达OsPMA2/H ⁺外排。结果表明OsSEC24对OsPMA2 在水稻原生质体中。 A.mCherry加GFP中H 通量的动力学双转基因水稻原生质体（左侧的空载体）， OsPMA2-mCherry单转基因原生质体（中间）和 OsPMA2-mCherry加OsSEC24-GFP双转基因原生质体对）。实验进行三次。 B.平均率 H ^{+ 通量，使用三次独立测量的平均值（平均值±SE）。 *表示p < 0.05使用Student's t检验，而 **表示p < 0.01使用Student's t 测试。 C. OsSEC24的位置（在囊泡中，有色绿色）和PMA2（在PM中，有色红色） ?水稻原生质体使用共聚焦显微镜和测量位置 ?NMT的H +选择性微电极。}

食谱

NMT的校准介质缓冲液（pH 7.0）
0.6 M甘露糖 4mM MES（pH 5.7）
4 mM KCl
154 mM NaCl 125mM CaCl 2。用HCl或NaOH将pH调节至7.0 储存在4°C
NMT的校准介质缓冲液（pH 5.0）
0.6 M甘露糖 4mM MES（pH 5.7）
4 mM KCl
154 mM NaCl 125mM CaCl 2。用HCl或NaOH将pH调节至5.0 储存在4°C
孵育溶液
0.6 M甘露糖 4 mM KCl
154 mM NaCl 125mM CaCl 2。 4mM MES（pH 5.7）
高压灭菌消毒（12±1℃，15分钟）后，在4℃保存
Mmg解决方案
15mM MgCl 2·h/v 0.6 M甘露糖 4mM MES（pH 5.7）
高压灭菌（121℃，15分钟）后，在4℃下保存
MS介质
4.43 g/L M519
88mM蔗糖用HCl或NaOH将pH调节至5.7 1％-1.5％琼脂分配培养基到正方形培养皿，并在121℃高压灭菌15分钟后在4℃下贮存
NT介质
4.43 g/L M519
88mM蔗糖 4.5mM 2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）使用HCl或NaOH将pH调节至5.8 高压灭菌（121℃，15分钟）后，在4℃下保存
原生质酶溶液
0.6 M甘露糖 10mM MES（pH 5.7）
在121℃下高压灭菌消毒15分钟后在4℃下储存，并在电镀酶解之前加入1mM CaCl 2，0.1％牛血清白蛋白，1.5％纤维素酶RS和0.75％大肠杆菌酶。
聚乙二醇（PEG） - 钙溶液
40％PEG3350
0.6 M甘露糖 0.1M CaCl 2
储存在4°C
用于NMT的标准培养基缓冲液（pH 6.0）
0.6 M甘露糖 4mM MES（pH 5.7）
4 mM KCl
154 mM NaCl 125mM CaCl 2。用HCl或NaOH将pH调节至6.0 储存在4°C
洗涤缓冲液
154 mM NaCl 5 mM KCl
125mM CaCl 2。 2mM MES（pH 5.7）
高压灭菌（121℃，15分钟）后，在4℃下保存

致谢

该协议改编自我们以前发表的论文Li （2015）。我们要感谢美国（北京徐越）NMT服务中心的技术支持。本研究由中国国家自然科学基金（基金编号：30770178和30971856），北京市国家科学基金重点基金项目（B）（编号KZ200710028013），北京市国家科学基金（5042004），和第七届北京市优秀教师奖（2011）。

参考文献

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Sun，T.，Li，P.，Yin，L.，Xu，Y.and Yu，S。（2007）。非侵入性扫描离子选择性电极技术及其在高等植物研究中的应用。自然科学进展 17（6）：625-629
Tan，S.，Han，R.，Li，P.，Yang，G.，Li，S.，Zhang，P.，Wang，W.B.，Zhao，W.Z.and Yin，L.P。 MxIRT1基因的过表达增加了水稻种子中的铁和锌含量。 em> Transgenic Res 24（1）：109-122。
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