材料和试剂

塑料培养皿
parafilm
Millex-GP过滤器单元0.22μm（Merck Millipore Corporation，型号：R4AA41572）
2-3周龄无菌拟南芥植物（生长的Murashige& Skoog固体培养基）
Murashige& Skoog培养基（Duchefa Biochemie，目录号：P11293.01）
Phytagel（Sigma-Aldrich，目录号：MFCD00131909）
NaOH
蔗糖
（2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）（Sigma-Aldrich，目录号：D7299）（参见配方）
6-苄氨基嘌呤（6-BA）（Sigma-Aldrich，目录号：83488）（参见配方）
Murashige& Skoog固体培养基（见配方）
愈伤组织诱导培养基（参见配方）

设备

拟南芥生长室
磁力搅拌器和搅拌棒
pH计
剪刀
镊子
流动缸

程序

制备无菌拟南芥植物
1. 准备Murashige& Skoog（MS）固体培养基
2. 高压灭菌 Murashige& Skoog（MS）固体培养基并倒入培养皿中当瓶子的温度达到50℃时，进入菜肴
3. 将拟南芥种子置于30％84漂白剂中10分钟以进行灭菌。丢弃漂白剂，用无菌水冲洗种子三次次。
4. 将10?15个灭菌的拟南芥种子置于每个培养皿上皿与MS固体培养基，并用石蜡膜密封陪替氏培养皿保持无菌和潮湿。
5. 将培养皿在4℃的黑暗中保存2-4天以进行春化处理
6. 在长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗）将培养皿转移到22℃的拟南芥生长室中。
7. 将拟南芥植物培养约2至3周，直到叶片宽度达到3-5mm（图1）。
  
  图1. 拟南芥在MS固体培养基上培养3周的植物。酒吧= 1厘米
制备愈伤组织诱导培养基
1. 准备并高压灭菌MS固体培养基。
2. 加入100μl的1 mg/L 2,4-D和1mg/L 6-BA进入MS固体培养基，命名为愈伤组织诱导介质，当瓶子的温度达到50℃时。确保这件事性能在流动柜中完成。
3. 将愈伤组织诱导培养基倒入培养皿中。确保性能在流动柜中完成。
叶外植体培养物
1. 确保步骤C11-13的所有演奏在流动柜中完成。
2. 用无菌剪刀切开叶和中脉，得到小条，其长度为约5mm，宽度为2mm，包括穿过宽度的中脉。确保类似成熟 ?玫瑰花叶被选择用于实验
3. 选择叶子条带相似的大小，并将其转移到相同的愈伤组织诱导介质用灭菌镊子（图2）
  
  图拟南芥叶条。条= 3毫米
4. 用石蜡膜密封培养皿以保持无菌和潮湿。
5. 将培养皿在22℃下在黑暗中保存1-2周。
6. 观察愈伤组织并拍摄照片（图3）。
  
  图3.叶外植体中的愈伤组织生长（Wang和Guo，2015）。 Callus 在转基因（第8行）的Col-0，35S-miR <159> > iaa28-ko 突变体，以及35S-IAA28-1 和PCsVMV-IAA28m 转基因植物。在第7天拍摄外植体而不更换培养基。条= 2mm

食谱

1mg/ml 2,4-D
将溶于20毫升2,4-D粉末的5毫升乙醇溶解，并在搅拌下，轻轻加水至20ml 随后，通过Millex-GP过滤单元（0.22μm）过滤灭菌，在流动室
中储存于-20°C
1 mg/ml 6-BA
将20mg 6-BA溶于5ml 0.1M NaOH溶液中，搅拌下，轻轻加水至20ml。
随后，通过在流动室
中的Millex-GP过滤器单元（0.22μm）过滤灭菌储存于-20°C
Murashige& Skoog固体培养基（1L）
4.4g Murashige& Skoog培养基
30克蔗糖 3.5克植物凝集素使用1M NaOH将pH调节至5.9
愈伤组织诱导培养基（1L）
Murashige& Skoog固体介质
100μl1mg/L 2,4-D
100μl1mg/L 6-BA

致谢

该协议由以下发表的论文开发：Hu等人（2000）。这项研究得到了科技部的支持（Grant2014CB138402）。

参考文献

Hu，Y.，Bao，F。和Li，J。（2000）。油菜素类固醇对细胞分裂的促进作用在拟南芥中涉及不同的CycD3诱导途径， Plant J 24（5）：693-701。
Rashmi，R。和Trivedi，M.P。（2014）。各种生长激素浓度和组合对愈伤组织诱导，愈伤组织的性质和肠炎反应的影响> Nerium odorum 。 Appl Biochem Biotechnol 172（5）：2562-2570。
Wang，J.J.and Guo，H.S。（2015）。由microRNA847切割INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE28 mRNA上调生长素信号，调节细胞增殖和侧向拟南芥中的器官生长。植物细胞27（3）：574-590。