材料和试剂

5mm直径圆形活检穿孔器（ABC，目录号：0418）
10％盐酸氯胺酮（AgropecuáriaTarum?，目录号：8565）
2％甲苯噻嗪盐酸盐（Syntec）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：255793）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
盐水溶液（0.9％氯化钠注射液）（Equiplex）
dH 2 2 O
70％酒精（见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.2,10x）（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.2,1×）（参见配方）

设备

数字卡尺（Mitutoyo，目录号：573-661）
脱毛机（Wahl和Toshico）

程序

在小鼠中创建皮肤切割伤口
1. 麻醉小鼠批准在你的动物研究提案。我们建议腹膜内注射氯胺酮100mg/kg和赛拉嗪的混合物 ?10mg/kg，在100μl盐水溶液中稀释。它给大约二十分钟的手术麻醉
2. 使用脱毛机从小鼠背部脱毛。
3. 使用适当的皮??肤消毒剂准备手术部位。我们建议70％的酒精。
4. 折叠和抬起背部皮肤头和尾在中线使用食指和拇指形成夹层皮褶（图1） ?1A）。然后，将动物放在侧面位置，并按下 5毫米直径无菌活检穿孔完全去除两个皮肤层（图1B），并创建对称的全厚度切除伤口（图1C）。
  
  图1。 ?逐步皮肤切除创伤手术。折叠并抬高背部皮肤在中线处并且尾部形成夹层皮肤褶（一个）。将动物放在侧面位置，穿透折叠 ?皮肤（B）以产生对称的全层切割伤口（C）
5. 手术后，将动物移动温暖并监测其从麻醉中的恢复。完全返回恢复动物到其常规住房。单独笼。
手术后伤口闭合监测
1. 如步骤A1中所述将动物麻醉，并且伤口面积为每2-3天评估直到完全闭合病变
2. 通过使用数字卡尺，测量其较大和较小直径损伤（图2），并通过应用确定伤口面积（直径A/2）×（直径B/2）×π。
3. 计算伤口闭合的百分比如下：[（原始面积）实际伤口的伤口面积）/原始伤口的面积]×100
  
  图2.伤口面积的评估。测量较大的（A）和次要（B）病变的直径。计算面积如下：（直径A/2）×（直径B/2）×π。

笔记

创建间隔约5 mm的伤口。
镇痛药的使用取决于实验设计和地方委员会批准在科学研究中保护和使用动物的伦理行为。推荐先用止痛药。我们建议在术后第一个24小时每12小时皮下注射丁丙诺啡0.05 mg/kg
全层皮肤切割伤口的实际表面积略大于其初始尺寸
为了实验的准确性和可重复性，面积测量必须由整个实验时间过程中的单个人进行。
如果皮肤将用于组织学分析，在收获伤口组织后，将其放置在夹层的滤纸上以避免在固定过程中的组织折叠，并将其置于组织盒中用于在10％福尔马林溶液中固定24小时。然后，按照常规石蜡包埋处理。否则，将收获的组织置于1.5ml微量管中，然后立即浸入液氮中以储存冷冻组织用于进一步的组织分析（例如生化分析，ELISA，qPCR，等）。 >）。有关如何收获伤口组织进行分析的详情，请参阅Cassini-Vieira等人（2015年）。

食谱

70％酒精溶液
700毫升绝对酒精
用蒸馏水将体积加到1000ml
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.2,10x）
NaCl 80g
Na 2 HPO 4 11.05g或Na 2 HPO 4 12.12H 2 O 29克
KCl 2 g

。

将dH <2> O添加至1,000 ml
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.2,1×） 50ml PBS（10x）
450ml dH 2 O

致谢

这项工作得到了Consueho Nacional de Pesquisa/CNPq，Coordè??odeAperfei?oamentode Pessoal deNívelSuperior/CAPES，Funda??ode AmparoàPesquisa de Minas Gerais/FAPEMIG和Pró-reitoria deGradua??oPROGRAD-UFMG，Brazil的支持。 CFM拥有PROBIC-FAPEMIG科学启动奖学金。 PCV持有CAPES博士奖学金。无国界医生拥有PROGRAD-UFMG本科生奖学金。 LSB拥有CNPq研究奖学金。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发布或准备手稿方面没有任何作用。

参考文献

Canesso，M.C.，Vieira，A.T.，Castro，T.B.，Schirmer，B.G.，Cisalpino，D.，Martins，F.S.Rachid，M.A.，Nicoli，J.R.，Teixeira，M.M.and Barcelos，L.S.（2014）。在没有共生微生物群的情况下，皮肤伤口愈合加速，无疤痕。 J Immunol 193（10）：5171-5180。
Cassini-Vieira，P.，Moreira，C.F.，da Silva，M.F.and Barcelos，L.S.（2015）。通过测量骨髓过氧化物酶（MPO）和N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶评估伤口组织嗜中性粒细胞和巨噬细胞累积NAG）活性。生物协议 5（22）：e1662。