材料和试剂

2ml微量离心管（Eppendorf）
圆形活检穿孔器（ABC，目录号：0418）
96孔微量培养板（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：21-377-203）
3％过氧化氢（H 2 O 2）（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）
3，3'-5,5'-四甲基联苯胺（TMB）（Sigma-Aldrich，目录号：T2885）
4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：N9376）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：251275）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：472301）
葡萄糖溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G8644）
硫酸（H 2 SO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：258105）
十六烷基三甲基溴化铵（HTAB）（Sigma-Aldrich，目录号：H9151）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
液氮
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Na 2 EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：V000114）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：255793）
磷酸三钠十二水合物（Na 3 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：222003）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（10x，pH 7.2）（参见配方）
PBS（1x）（请参阅配方）
缓冲区1（请参阅配方）
缓冲区2（参见配方）
H 2 O 2（0.002％v/v）（Sigma-Aldrich，目录号：7722-84-1）（参见Recipes）
MPO底物溶液（参见配方）
盐水 - Triton缓冲液（见配方）
磷酸盐 - 柠檬酸盐缓冲液（参见配方）
NAG底物溶液（参见配方）
甘氨酸缓冲液（参见配方）

设备

冷冻（-20°C）
冷冻（-80℃）
高精度实验室天平（Shimadzu Coopration，目录号：ATX-224）
微量移液器
微孔板分光光度计读数器（Molecular Devices，型号：SpectraMax）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810R）
组织匀浆器（Thermo Fisher Scientific，目录号：PowerGen 125）
涡旋混合器（VELP Scientifica，目录号：F202A0171）

程序

收获伤口组织
1. 在动物安乐死后收获伤口。麻醉过量是 ?安乐死的首选方法。避免颈椎脱位断头法。
2. 首先，去除小鼠的背部皮肤并借助于圆形活组织检查小心地除去伤口组织冲头（具有比所采用的直径稍大的直径伤口）以收集整个伤口区域（加上皮肤周围约2mm） ?组织）（图1A-D）
3. 将新鲜样品（收获的组织）放在2ml微量离心管中，立即浸入液氮中
4. 将收获的组织储存在-80℃直至使用
5. 对于切除伤口愈合模型，参见Moreira等人（2015）。
  
  图1.收获伤口组织进行分析。安乐死后，去除小鼠的背部受伤皮肤（A）。放置较大的圆形冲击皮肤病变，按下，慢慢旋转除去a 圆形皮肤片（B-C）。收集NAG和MPO分析（D）由立即将含有组织的微量离心管浸入液氮。
MPO酶分离和测定（图2）
1. 在冰冷的缓冲液1（100 mg组织/1 ml）中称重并匀浆组织 ?缓冲液），使用动力高速组织匀浆器（Ultra-turrax或 ?当量）。酶分离过程中的匀浆程序必须在冰上进行
2. 在4℃下以10,000×g离心10分钟。
3. 弃去上清液，将沉淀物置于低渗裂解液中将沉淀重悬在1ml的0.2％NaCl中30秒，然后加入1.0ml 1.6％NaCl/5％葡萄糖溶液
4. 在4℃下以10,000×g离心10分钟。
5. 弃去上清液，并将沉淀重悬于缓冲液2（100 mg组织/1 ml缓冲液）中
6. 涡旋，然后使用液氮冻融三次。解冻步骤可以在自来水下进行。
7. 在4℃下以10,000×g离心15分钟
8. 保存上清液用于酶测定（如果MPO测定是不立即进行，上清液可以在-20℃下保存直到使用）。
9. 在室温下稀释缓冲液2中的样品（我们建议1：3，但稀释应通过实验调整）
10. 为了测定，加入25μl稀释的上清液样品（或缓冲液2，用作空白）到96孔微量培养板中。所有样品应运行 ?一式两份
11. 加入25μlMPO底物溶液
12. 在37℃孵育5分钟。
13. 加入25μl0.002％H 2 O 2 sub。
14. 在37℃孵育5分钟。
15. 最后，停止与25μl1M H 2 SO 4 4的反应。
16. 在450 nm读取。
17. 计算MPO的相对活性如下：（样品吸收光谱 - 空白吸收光谱）x样品稀释因子。以相对单位（MPO活性/100mg）表示结果表示MPO每100mg组织的活性
  
  图2. MPO测定程序总结
NAG酶分离和测定（图3）
1. 在冰冷的Saline-Triton缓冲液（100 mg）中称取并匀浆组织 ?组织/1ml缓冲液），使用动力高速组织匀浆器（Ultra-turrax或等同物）。酶的匀浆程序必须在冰上进行隔离
2. 在4℃下以3,000xg离心10分钟。
3. 保存上清液用于酶测定（如果NAG测定是不立即进行，上清液可以在-20℃下保存直到使用）。
4. 稀释测定样品在磷酸盐 - 柠檬酸盐缓冲液中（我们建议1：3，但稀释度应该调整实验）。
5. 为了测定，加入25μl稀释的上清液样品（或磷酸盐柠檬酸盐缓冲液，用作空白）加入96孔 ?微孔板。所有样品应重复运行（图4）。
6. 加入25μlNAG底物溶液
7. 在37℃孵育10分钟。
8. 最后，停止反应与25μl的0.2M甘氨酸缓冲液。
9. 在400 nm读取。
10. 计算NAG的相对活性如下：（样品吸收光谱 - 空白吸收光谱）x样品稀释因子。 ?表示作为相对单位（NAG活性/100mg）的结果 NAG每100mg组织的活性
  
  图3. NAG测定程序总结
  
  图4. 96孔NAG/MPO板布局。空白和样品的示例分配。所有样品应重复运行。对于NAG，空白 ?是磷酸盐 - 柠檬酸盐缓冲液，对于MPO是缓冲液2。

笔记

保存用于酶测定的冷冻上清液必须在4℃下解冻，并在处理期间保持在冰上
使用合适的超永久耐墨笔，可以抵抗在液氮温度下冻结和解冻的严重性，以正确识别将用于MPO酶分离程序的微量离心管。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（10x，pH 7.2）
NaCl 80g（最终浓度为137mM）
Na 2 HPO 4 11.05g（或Na 2 HPO 4 sub）12.12g Na 2 HPO 4 11.05g（或Na 2 HPO 4） 2×29g）（8.01mM终浓度） KCl 2g（2.7mM终浓度） KH 2 PO 4 4 2.1g（最终浓度为1.5mM）
MilliQ水qsp 1000 ml
PBS（1x）
PBS（10x）50ml
MilliQ水450 ml
缓冲液1（pH 4.7）
NaCl 5.84g（终浓度0.1μM） Na 3 PO 4 4.12g（0.02M最终浓度）
Na 2 EDTA 5.58g（仅在pH调节后加入）（0.015M终浓度）
MilliQ水qsp 1000 ml
缓冲液2（pH 5.4）
（最终浓度为0.05M）的NH 3/Na 3 PO 4 4 HTAB 5g（仅在pH调节后加入）（0.5％p/v终浓度） MilliQ水qsp 1000 ml
H 2 O 2（2.4mM终浓度） 3％H 2/2 O 27.0μl
缓冲液2 12 ml
MPO底物溶液（1.6mM终浓度;避光）
TMB 3.845mg
DMSO 1ml
盐水 - Triton缓冲液（Triton X-100 0.1％v/v终浓度）盐水溶液（0.9％） - NaCl 9g在MilliQ水qsp 1000ml
中 Triton X-100 1 ml
磷酸盐 - 柠檬酸盐缓冲液（pH 4.5）
溶液A-柠檬酸9.6g在MilliQ水qsp 500ml（0.1M终浓度）中溶液B-Na 2 HPO 4 17.9g在MilliQ水中qsp 500ml（0.1M终浓度）
混合200ml溶液A和310ml溶液B
NAG底物溶液（终浓度为2.24mM;避光）
对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷0.767mg
磷酸盐 - 柠檬酸盐缓冲液1ml
涡旋，然后超声处理悬浮液10秒
甘氨酸缓冲液（0.2M终浓度; pH 10.6）溶液A-甘氨酸6.008g在MilliQ水qsp100ml（0.8M终浓度）中溶液B-NaCl 4.68g在MilliQ水qsp 100ml（0.8M终浓度）中溶液C-NaOH 3.2g在MilliQ水qsp 100ml（0.8M终浓度）中混合溶液A，B和C

致谢

这项工作得到了Consueho Nacional de Pesquisa/CNPq，Coordè??odeAperfei?oamentode Pessoal deNívelSuperior/CAPES，Funda??ode AmparoàPesquisa de Minas Gerais/FAPEMIG和Pró-reitoria deGradua??oPROGRAD-UFMG，Brazil的支持。 CFM拥有PROBIC-FAPEMIG科学启动奖学金。 PCV持有CAPES博士奖学金。无国界医生拥有PROGRAD-UFMG本科生奖学金。 LSB拥有CNPq研究奖学金。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发布或准备手稿方面没有任何作用。我们感谢Maria Cecilia Campos Canesso和Thiago Bruno Rezende de Castro在测定设置期间提供技术支持。

参考文献

Bailey，P.J。（1988）。海绵植入物作为模型。方法Enzymol 162：327 -334。
Canesso，M.C.，Vieira，A.T.，Castro，T.B.，Schirmer，B.G.，Cisalpino，D.，Martins，F.S.Rachid，M.A.，Nicoli，J.R.，Teixeira，M.M.and Barcelos，L.S.（2014）。在没有共生微生物群的情况下，皮肤伤口愈合加速，无疤痕。 J Immunol 193（10）：5171-5180
Moreira，C.F.，Cassini-Vieira，P.，da Silva，M.F.and Barcelos，L.S。（2015）。皮肤伤口愈合模型 - 切除伤口和病变面积评估生物方案< em> 5（22）：e1661。
Kuebler，W.M.，Abels，C.，Schuerer，L。和Goetz，A.E。（1996）。通过改良的骨髓过氧化物酶测定法测量脑和肺组织中的嗜中性粒细胞含量。 Int J Microcirc Clin Exp 16（2）：89-97。