材料和试剂

塑料制品/耗材
1. 15ml聚丙烯管（SARSTEDT AG& Co，目录号：62554502）
2. 50ml聚丙烯管（SARSTEDT AG& Co，目录号：62548004）
3. 100μm的尼龙网（Biologix Group Limited，目录号：151100）
4. 40μm尼龙网（Biologix Group Limited，目录号：151040）
5. 250ml离心管（Bartelt，目录号：9.315721）
6. 1.5ml和2ml微升反应管
7. 注射器过滤器0.2μm（Bartelt，目录号：9055511）
8. 具有细胞过滤帽的BD Falcon 12x75mm管（BD Biosciences，目录号：352235）
  注意：目前，它是"康宁公司，目录号：352235"。
9. 一次性皮下注射针，直径为0.45×25 mm（B.Braun Melsungen AG，Braun Petzold，目录号：4657683）
10. 移液管吸头（1,000μl，200μl，20μl，2μl）
11. 酸洗玻璃珠（见配方）
玻璃器皿
1. 玻璃珠0.4-0.6mm（Sartorius AG，??目录号：BBI8541701）
2. 250ml锥形瓶
3. 玻璃管
4. 玻璃滑槽
5. 封面
植物材料
1. 100开花的野生型拟南芥植物（Col-0登记号和dml-3突变体作为实例）（Arabidopsis，目录号： SALK_056440）
化学品
1. D（+） - 蔗糖用于分析（AppliChem GmbH，目录号：131621.0914）
2. DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：D1306）
  注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM ，目录号：D1306"。}
3. SYBR Green I核酸染色原液（Life Technologies，目录号：S7567）
  注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM ，目录号：S7567"。
4. 苯基甲磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：93482）
5. 完全，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
6. 氯化钙二水合物（AppliChem GmbH，目录号：A3587）
7. 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：8043）
8. 乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
9. Ficoll？PM 400（Sigma-Aldrich，目录号：F4375）
10. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
11. 醋酸镁四水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M5661）
12. 氯化钠（EMD Millipore Corporation，目录号：106404）
13. 氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
14. D-山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S6021）
15. 精胺[N，N'-双 - （3-氨基丙基）-1,4-二氨基丁烷]（AppliChem GmbH，目录号：A0672.0005）
16. TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：234729）
17. Tris-base（AppliChem GmbH，目录号：A1086）
18. 硝酸65％（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：X898.1）
19. 盐酸发烟37％（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：4625.1）
20. 氢氧化钠颗粒（AppliChem GmbH，目录号：A3910）
21. 超纯水（MilliQ）（电导率>18MΩ<1cm -1 -1 ）
缓冲区
1. BD FACSFlow鞘液（BD Bioscience，目录号：342003）
2. 蔗糖溶液（见配方）
3. 缓冲区A（参见配方）
4. 缓冲液B（参见配方）
5. 蛋白酶抑制剂储备溶液（参见配方）
6. DAPI储备溶液（见配方）

设备

仪器
1. 带有JA-10转子的Beckman Coulter Avanti J-26XP离心机
2. 台式离心机
3. 轨道振动器（VWR International，目录号：89032102）
4. 干燥炉（EHRET GmbH，目录号：3108）
5. Bead-beater（Retsch GmbH，型号：MM301）
6. 带有20x，40x和100x物镜和DAPI滤光片的荧光显微镜
7. 流式细胞仪：具有70μm喷嘴的FACS Aria I（BD Biosciences） ?70psi护套压力，以及488nm相干蓝宝石固态13 mW激光器和用于检测的530/30nm带通滤波器的SYBR绿色I
一般实验室设备
1. 烧杯
2. 250ml锥形烧瓶
3. 玻璃管
4. 锋利的剪刀
5. 镊子
6. 空气移液管
7. 冰容器

软件

流式细胞术软件（BD Biosciences，型号：FACS Diva 6.1.2）

程序

释放 A。如先前所述（Honys和Twell，2003; Johnson-Brousseau和McCormick，2004; Schoft等人，2009），其具有修改]
（来自花序的
1. 将?100株植物（拟南芥）在16小时光照/8小时黑暗条件下生长5周循环在22℃。植物的发育阶段对应于6.10至 ?6.50根据表2在Boyers等人（2001）。
2. 通过用锋利的剪刀剪切将所有花序收集在烧杯中（置于冰上）。
3. 将9％冰冷的蔗糖溶液倒在收集的上花序直到被覆盖。花序是剧烈旋转一分钟以释放成熟花粉粒
4. 将悬浮液通过100μm尼龙网过滤到置于冰上的250ml离心管中
5. 花粉颗粒通过在4℃下以1350×g离心10分钟浓缩。
6. 将上清液倒回到花序上，并再次重复步骤3-5
7. 将花粉沉淀重悬于冰冷的缓冲液A中至最终体积为10ml，并通过40μm的尼龙网过滤到15ml 猎鹰管。
8. 花粉颗粒通过在4℃以800×g离心10分钟沉淀
9. 花粉颗粒再次用1ml缓冲液A洗涤通过在37℃下离心收集在无菌的1.5ml管中在桌上型离心机中在4℃下5分钟，5分钟。上清液舍弃。
  注意：
  1. 收集花序和释放花粉需要约2-3小时。
  2. 沉淀的花粉可以立即使用或快速使用在液氮中冷冻并在-80℃保存几年。
  3. 100只拟南芥植物（Col-0生态型）产生约100μl花粉。花粉粒体体积通过填充相同的空管来估计用水达到与花粉相同的水平并测量水体积用空气置换移液管。此金额可能会有所不同 ?加入，生长条件和植物年龄。
隔离 A。 thaliana 花粉核的成熟花粉
1. 10-20个无菌2ml离心管中各装入1.8g 酸洗玻璃珠。未使用的管可以在室温下储存并稍后使用。
2. 将收获的花粉与缓冲液A混合补充有PMSF和蛋白酶抑制剂花粉与缓冲液A比率：
  在花粉颗粒体积80μl下比例为1：3（花粉：缓冲液A）的比例在80μl和150μl之间 ?使用1：3.5，高于150μl，使用1:4的比例花粉颗粒在缓冲液A中的再悬浮
3. 花粉粒将悬浮液小心地移液到装有2ml离心管中 ?玻璃珠（在步骤B1中制备）以50μl等分试样
4. 花粉通过放置填充的2ml管对颗粒进行珠磨与花粉悬浮液和玻璃珠在Retsch球磨机和，随后，在15Hz下运行打浆方案1.5分钟。
5. 用新鲜的管子将三个孔冲入管的底部针。小心地切下盖子，并放置2ml管也取下了其盖子的无菌1.5ml管的顶部。的然后将两个管放入用于离心的玻璃管中将在1.5ml管中回收核悬浮液（或者，可以使用15ml Falcon管）（图1A）。
6. 将玻璃管在4℃下以800×g离心10分钟。 2毫升弃去含有玻璃珠的管并且除去核将悬浮液合并到单个无菌的1.5ml离心管中
7. 将10μl花粉核悬浮液与1μlDAPI混合水并吸移到载玻片上。仔细放置盖玻片 ?在样品顶部。花粉核释放的效率和质量的细胞核用荧光显微镜使用20x和40x评估 ?目标和DAPI通道[DAPI的激发/发射（nm）： 358/461]（图1B和C）
  A
  
  图1.评估 A。 thaliana 花粉核释放效率。 A.三管设置前后离心。 B.A的显微镜图像。拟南芥野生型（Col-0）花粉在珠打之前，DAPI：用DAPI染色的花粉检查 DAPI过滤器。 40x放大。尺寸条：25μm。 C.A的显微镜图像。拟南芥野生型花粉（Col-0）。箭头：（1）完整花粉，（2）细胞核仍附着于细胞质，（3）空花粉壳，（4）释放营养核。 DAPI：DAPI染色的花粉用DAPI过滤器检查。 40x放大。尺寸栏：25μm
  
  注意：
  1. 离心管应尽可能保持在4°C。
  2. 花粉的体积与缓冲液A的体积之间的比率为 ?对于花粉壁的最佳破坏至关重要。所描述的比率这里导致?80-90％的破坏效率。如果花粉调整比率保持完好，或者如果样品被严重损坏，因为这将导致在低产率的核。更多缓冲区提高打破效率（和损害的风险）。
  3. 为了优化跳动协议，我们建议使用两个不同的频率和运行的跳动协议为1， 1.5和2分钟。 10个等份的六个样品应该与1混合 μlDAPI工作溶液，并在显微镜下检查。 70-90％的花粉粒应该破碎，大多数释放的核应该 float在解决方案中。
  4. 如果释放的细胞核溶胀并变黄，请检查缓冲液的pH值。
  5. 花粉核的分离需要大约一小时。
分数A。 thaliana 精子和营养细胞核通过荧光激活细胞分选
1. 细胞分选仪装配有70μm喷嘴和鞘压力 ?调节至70psi。对于激发，488nm相干蓝宝石使用固态13mW激光器。检测到SYBR绿色荧光通过530/30nm带通滤波器。使用冷却单元保持样品并在整个过程中在4℃分离核。两个标签将15ml Falcon管置于装置中作为收集管
2. 用0.5体积的缓冲液B稀释核悬浮液通过用35μm细胞过滤将250μl转移到FACS管中过滤器帽
3. 将5μl的SYBR Green I移液至其中一个样品，混合，并孵育5分钟。保存另外的FACS管 ?在冰上，并在分拣前用SYBR Green I染色
4. 使用 FACS Diva 6.1.2软件，制备了新的FACS图在y轴上的SSC-A（侧向散射区域）和在x轴上的FITC-A（面积） ?两者在线性标度上。
5. 为了开始分选，将未染色的样品作为阴性对照进行分析
6. 接下来，将SYBR Green I染色的细胞核装载到FACS中设备。两个荧光种群出现在FACS图上单独门控。对于门控，在最密集部分周围画一个正方形 ?的人口。异常值被忽略。沿y轴的门是不是那么关键，而必须小心避免沿着该地区 ?x轴，其中两个群体重叠以确保分选的纯度人口。避免分选聚集体，如两个粘附精子核，设置了仅显示门控的辅助图在第一个图中。这个辅助图在y上具有FITC-W（FITC宽度） ?轴和FITC-A（FITC面积）在x轴上显示的差异 FITC-W值，其在聚集体中高于单核。的图2B和D中标记的两个核群体代表所需的 ?核并进行门排序。该图中的所有事件都是门控的。一旦样品管为空，装载新鲜染色的样品管进入FACS设备
  
  图2.花粉核的FACS图 A.野生型。 thaliana （Col-0）花粉核显示为侧散射对FITC-A（FITC面积）的线性尺度上的所有事件。 B.在y轴和FITC-A上具有FITC-W（FITC宽度）的辅助图（FITC区域）在x轴上的线性刻度显示事件门控图（A）。左边的人群由精子细胞核组成，右边群体代表营养核。两个群体都是门控的 ?用于排序。 C.Dml-3突变体（SALK_056440）。 thaliana 花粉核显示为所有事件的侧散射对FITC-A（FITC面积）线性尺度。 D.图（C）的辅助图。

食谱

酸洗玻璃珠
1. 小心地将玻璃珠倒入250ml锥形烧瓶中。不要加入超过100毫升的玻璃珠。
2. 用硝酸覆盖玻璃珠，并在烧瓶中摇动轨道振荡器过夜。使用允许玻璃珠的速度设置移动一点。
3. 弃去硝酸，用水洗涤玻璃珠直到pH值为中性
4. 除去水，在180℃的干燥炉中对玻璃珠灭菌4小时。
蔗糖溶液（工作溶液9％，原料45％）
1. 将450g蔗糖溶解在1L水中，高压灭菌并保持在室温
2. 稀释1：5用无菌水稀释工作溶液。
缓冲区A
1. 1μM山梨醇，7％ficol PM 400,5mM MgAc，3mM CaCl 2，5mM EGTA，50mM Tris-HCl（pH 7.5），100％Triton X100，甘油。 >
2. 混合9.1g山梨醇，3.5g Ficoll PM 400,0.05g乙酸镁，0.022g CaCl 2，0.095g EGTA和0.3g Tris的35ml无菌水溶液。
3. 用1M HCl调节pH至7.5
4. 加入1ml Triton x100（终浓度2％）和10ml甘油（终浓度20％）。储存于4°C。该解决方案可用于 3-4周。
5. 应在使用前加入蛋白酶抑制剂混合物（1:50稀释）和PMSF（1：100稀释）。
缓冲区B
1. 15mM Tris-HCl（pH7.5），2mM Na 2 EDTA，0.5mM精胺·HCl，80mM KCl，20mM NaCl，2％Triton×100。
2. 库存解决方案：
  1. 对于1M Tris-HCl，溶解6.05g在30ml水中，调节pH至 7.5用5M HCl，并用无菌水加热至50ml，高压灭菌;
  2. 对于0.5M EDTA，用NaOH调节350ml水的pH至8 颗粒并缓慢加入盐，同时搅拌，使水达500 ml，高压灭菌;
  3. 对于1M精胺，将0.2g溶于10ml水（最终体积），无菌过滤器中;
  4. 对于3M KCl，在100ml水（最终体积）中溶解22.365g，高压灭菌;
  5. 对于5M NaCl溶于29.22g在100ml水（最终体积）中，高压灭菌
  6. 对于5ml工作溶液混合物75μlTris-HCl，20μlEDTA，25μl 精胺，133μlKCl，20μlNaCl和100μlTriton X-100，达到5 ml用无菌水
  7. 储存在4°C。
  8. 应在使用前加入蛋白酶抑制剂混合物（1:50稀释）和PMSF（1：100稀释）。
蛋白酶抑制剂储备液
对于50倍浓度，将一片溶解在1ml水中
DAPI（工作溶液10μg/ml;储备2mg/ml）
1. 加入5毫升无菌水至10毫克DAPI粉末的储备溶液
2. 用工作溶液（"DAPI水中"）的无菌水稀释储备溶液1：200
3. 避光
4. 储存于-20°C

致谢

该协议基于以前公开的工作（Schoft等人，2009; Schoft等人，2011; Ibarra等人，2012年） ; Schoft等人，2015）。我们感谢维也纳分子病理学研究所的BioOptics设施，用于设置和优化FACS。我们感谢Gerald Schmauss测量排序的大小。 thaliana 花粉核。我们感谢Hisashi Tamaru的支持。这项工作得到奥地利科学基金（FWF）拨款P21389-B03和P24918-B21的支持。

参考文献

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Borges，F.，Gardner，R.，Lopes，T.，Calarco，J.P.，Boavida，L.C。，Slotkin，R.K.，Martienssen，R.A。和Becker，J.D。（2012）。基于FACS的拟南芥小孢子，精细胞和营养核的纯化。植物方法 8（1）：44.

Honys，D。和Twell，D。（2003）。拟南芥花粉转录组的比较分析 > Plant Physiol 132（2）：640-652。

Ibarra，CA，Feng，X.，Schoft，VK，Hsieh，TF，Uzawa，R.，Rodrigues，JA，Zemach，A.，Chumak，N.，Machlicova，A.，Nishimura，T.，Rojas，，Fischer，RL，Tamaru，H。和Zilberman，D。（2012）。植物伴侣细胞中的活性DNA去甲基化加强了配子中的转座子甲基化。科学 337（6100）：1360-1364。

Johnson-Brousseau，S.A。和McCormick，S。（2004）。有用于表征拟南芥花粉突变体和配子体表达的方法纲要基因。植物J 39（5）：761-775。

Schoft，V.K.，Chumak，N.，Bindics，J.，Slusarz，L.，Twell，D.，Kohler，C.and Tamaru，H。 SYBR绿色激活的拟南芥花粉核的排序基于不同的DNA/RNA内容植物Reprod 28（1）：61-72

Schoft，VK，Chumak，N.，Choi，Y.，Hannon，M.，Garcia-Aguilar，M.，Machlicova，A.，Slusarz，L.，Mosiolek，M.，Park，JS，Park，GT，Fischer ，RL和Tamaru，H。（2011）。 DEMETER DNA糖基化酶在拟南芥雄性配子体中的功能。 Natl Acad Sci USA 108（19）：8042-8047。

Schoft，V.K.，Chumak，N.，Mosiolek，M.，Slusarz，L.，Komnenovic，V.，Brownfield，L.，Twell，D.，Kakutani，T.and Tamaru，在组成型异染色质的去扩缩时诱导RNA指导的DNA甲基化。 EMBO Rep 10（9）：1015-1021。