材料和试剂

塑料撒布机（Excel Scientific，目录号：5PR-L-510）
Falcon管（15ml）（Corning Inc.，目录号：352196）
培养皿（100×15mm）（Corning Inc.，目录号：351029）
培养皿（60×15mm）（Corning Inc.，目录号：351007）
接种针（VWR International，目录号：12000-816）
玻璃小瓶（10ml）（VWR International，目录号：SC66022-300）
铝箔
绿脓假单胞菌培养物
烟曲霉文化
D-葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Alfa Aesar，目录号：A1682836）
无水葡萄糖（VWR International，BDH，目录号：BDH9230500G）
酵母提取物（BD，Bacto ^TM，目录号：288620）
琼脂（Merck Millipore Corporation，目录号：EM1.01614.0500）
蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：212120）
Luria-Bertani（LB）脱水培养基（Merck Millipore Corporation，目录号：1.10285.5000）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S5881）
GR ACS硝酸钠（NaNO 3）（Merck Millipore Corporation，目录号：SX06551）
NaCl
氯化钾（KCl）（VWR International，BDH，目录号：0395VBD500G）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，Alfa Aesar，目录号：1159436）
硼酸（H 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
硫酸镁七水合物（MgSO 4）7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O·5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C8027）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251）
钼酸铵四水合物[（NH 4）6 Mo 6 Mo 7 O 24] 4H 2 O]（Sigma-Aldrich，目录号：431346）
硫酸锰（II）一水合物（MnSO 4·H 2·H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M7634）
硫酸铁（II）七水合物（FeSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：F8633）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Na 2 EDTA二钠2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：E4884）
氯化钴（II）六水合物（CoCl 2·6H 2 O，6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：255599）
吐温20溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
氯仿（VWR International，BDH，目录号：PL049ZA4）
乙腈（Honeywell International Inc.，目录号：AH015-4）
PBS-0.01％吐温20缓冲液（参见配方）
20x硝酸钠溶液（见配方）
微量元素（参见配方）
中等配方（参见配方）
1. 固体Luria-Bertani（LB）脱水培养基（参见配方）
2. 固体酵母提取物 - 蛋??白胨 - 葡萄糖培养基（YPD）（参见Recipes）

设备

孵化器（VWR International，型号：1535）
轨道摇床（Eppendorf AG，New Brunswick Scientific，型号：I26）
用转子（Beckman，型号：JLA-10.500）离心（Beckman，型号：J20）
显微镜（Celestron，型号：44345）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3500）
钢芯（直径38.1mm）（图1）

图1. Steel corer
钢刀片（VWR International，目录号：55411-050）
钢杵（VWR International，目录号：62400-336）
0.2μm孔径亲水性过滤器（VWR International，目录号：28145-477）
玻璃培养管（15ml）（VWR International，目录号：47729-583）
玻璃离心管（15ml）（SP Industries，Wilmad-LabGlass，目录号：C-8060-15）
氮气瓶

程序

假单胞菌和曲霉菌的生物膜共培养
1. 绿脓杆菌培养准备
  1. 将来自-80℃甘油原液的条纹接种绿脓杆菌 PA14菌株在固体上 ?LB培养基在100×15mm培养皿中，并在37℃孵育24小时
  2. 在即将用于共培养实验之前，接种5ml 的液体LB培养基在具有单个菌落的15ml玻璃培养管中来自步骤A1a中的PA14LB固体培养基，并在37℃，225℃下孵育 ?rpm 14小时至早期稳定期。
2. 烟曲霉分生孢子制剂
  1. 从?10℃的曲霉菌的甘油储备液中取出约10μl的塞子烟曲霉AF293，使用无菌接种针并在固体上划线 ?葡萄糖基本培养基（GMM）在100×15mm培养皿中并孵育在37℃下培养5天（图2）
    
    图2. A的示例。烟曲霉 AF293条纹培养在37℃孵育5天后
  2. 使用前，立即加入5ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）-0.01％吐温20缓冲液（pH7.2）加入到真菌平板中并温和用无菌塑料撒布机刮除真菌菌落的表面。
  3. 从培养皿收集分生孢子悬浮液，并转移到15毫升Falcon管。
  4. 在5,000×g离心分生孢子悬浮液5分钟。丢弃上清液并用5ml PBS-0.01％Tween再悬浮分生孢子沉淀 20缓冲液。
  5. 用PBS-0.01％吐温20稀释分生孢子悬浮液 ?缓冲液至终浓度为1至2×10 6分生孢子/ml。使用血细胞计数器量化分生孢子数（图3）。
    
    图3. A的示例。烟曲霉显微镜下的分生孢子
3. 假单胞菌和曲霉菌共培养生物膜制剂
  1. 倒入10ml高压灭菌的YPD固体培养基（1.6％琼脂）（底层） ?装入60×15mm培养皿中并在室温下固化。
    注意：准备多个YPD琼脂平板用于不同的共培养时间点和重复。
  2. 高压灭菌YPD固体培养基（0.5％琼脂）（顶层），在50℃水浴中冷却15分钟。
  3. 在YPD顶层冷却后，接种新鲜制备的和涡旋混合的曲霉属分生孢子悬浮液至终浓度 3.33×10 5分生孢子/ml
  4. 混合含有分生孢子的YPD顶层，并将3ml混合的顶层倒在固化的底层上。
    注意：高温灭菌琼脂的高温会杀死曲霉菌分生孢子。因此，关键是确保YPD的温度顶层被冷却到中等瓶可以的程度举行用手。同时，如果温度，琼脂将凝固 ?滴太多。步骤A3c-d应尽快完成。
  5. 一旦顶层固化，孵化板（真菌生物膜面向上）在25℃下12小时。
    注意：烟曲霉生长慢于铜绿假单胞菌。 12 h预培养是必要的，以避免压倒性的细菌生长。
  6. 点接种新鲜制备的10微升等分固定相位P。铜绿色 PA14 LB液体培养在中心进行真菌草坪
  7. 将共培养生物膜（共培养生物膜面朝上）在25°C孵育另外7天。
    注意：
    1. 见图5的共培养生物膜的例子。
    2. 关键是同步铜绿假单胞菌的生长（24小时）和烟曲霉（5），在制备共培养生物膜之前
代谢物提取
1. 经过不同的生长期（例如，每两天后接种），用无菌钢芯钳切割共培养生物膜（直径38.1mm），其包括共培养生物膜
2. 使用无菌刀片将38.1 mm直径的提取芯切割成四等分四分之一
3. 将四分之一（约285mm 2的表面）转移到玻璃培养管注意：转移共培养生物膜和支持琼脂（图4）。
  
  图4.切割共培养板的示例
4. 加入4ml milli-Q水，并用研杵匀浆
5. 加入4ml氯仿，盖上试管，并剧烈涡旋15分钟
6. 将混合物转移到15ml玻璃离心管中
7. 以500×g离心10分钟。
8. 收集水相上清液，并通过0.2μm孔径的亲水性过滤器过滤
9. 收集1.5ml氯仿相到10ml玻璃小瓶中
10. 使用温和的氮气流将氯仿蒸发至干
11. 用1.5ml 50/50％乙腈/水溶液的混合物重新溶解干燥的提取物。
  注意：此溶解溶剂可用于评估具有与假单胞菌相似化学性质的代谢物吩嗪，其在Zheng等人（2015）。
12. 如果提取的样品含有在乙腈中不稳定的代谢物例如5-甲氧基 - 吩嗪-1-羧酸（5-Me-PCA）在步骤B9之后另一个1.5ml等分的氯仿相，蒸发至在温和的氮气流下干燥并重新溶解于1.5ml milli-Q水。
  注意：大多数细菌和真菌代谢物是轻的 ?敏感，因此，强烈建议保护提取物通过用铝箔包装所有容器来照亮。

代表数据

图5.铜绿假单胞菌PA14野生型（中心菌落）和烟曲霉AF393野生型（皱纹生物膜周围环境）的共培养生物膜的代表性图像细菌菌落）在25℃孵育6天后

笔记

在共培养接种之前保持细菌和真菌的相同预培养条件是至关重要的。对于真菌，你需要确保相同的预培养时间。对于细菌，在本实验中推荐早期的固定相培养。 OD 600可以测量以检查细菌生长。如果使用不同的真菌和/或细菌菌株，强烈建议在不同的预培养时间进行一系列的共培养，以确定获得最佳结果的条件。
共培养生物膜可以在不同尺寸的各种培养皿中生长。您可以根据您的研究需要，扩大或缩小共同文化的维度。注意，共培养生物膜生长可以在不同类型的培养皿中变化

食谱

PBS-0.01％吐温20缓冲液（1L）

NaCl
8克

KCl
0.2 g

Na HPO ₄
1.42克

KH ₂ PO ₄
0.24克

吐温20溶液
0.1 ml

在约900ml milli-Q水中混合并用5M NaOH溶液将pH调节至7.2 用milli-Q水调节体积至1升，高压釜
20x硝酸钠溶液

NaNO ₃
120克

KCl
10.4克

MgSO 4。。 O
10.4克

KH ₂ PO ₄
30.4克

添加milli-Q水至1 L
高压灭菌并在室温下贮存

微量元素（100 ml）

ZnSO 4 。 7H O	2.2 g
H ₃ BO ₃	1.1克
MnSO 4 ^。 H sub 2 O	0.43克
FeSO 4 ^。 7H <2> O	0.5克
CoCl <2> ^。 6H <2> O	0.17克
CuSO 4 ^。 5H sub 2 O	0.16 g
（NH 4）6 Mo 7+ O 24+。在本发明的一个实施方案中， O	0.11g
Na EDTA ^。 2H 2	4.9克

将固体加入到80ml milli-Q水中，在添加下一个
之前完全溶解加入20ml 1M NaOH溶液，将pH调节至6.5 混合溶液直到固体完全溶解

中等配方
1. 固体葡萄糖基本培养基（GMM）（1L）
  
  20x硝酸钠盐 50 ml
  
  微量元素（使用前混合）
  1 ml
  
  D-葡萄糖
  10克
  
  琼脂
  16克
  
  在900ml milli-Q水中混合并用5M NaOH溶液调节pH至6.5 用Milli-Q水调节音量至1 L
2. 固体酵母提取物 - 蛋??白胨 - 葡萄糖培养基（YPD）（1L）
  
  无水葡萄糖
  20克
  
  酵母提取物
  10克
  
  细菌蛋白胨
  20克
  
  琼脂
  16克
  
  微量元素（使用前混合）
  1 ml
  
  在900ml milli-Q水中混合，用milli-Q水调节体积至1L，并用高压釜
3. 固体Luria-Bertani（LB）脱水培养基（1L）
  
  Luria-Bertani中等粉末
  25克
  
  *琼脂
  16克
  
  在900ml milli-Q水中混合，用milli-Q水调节体积至1L，并用高压釜
  注意：*在制备液体LB培养基时不要添加琼脂。

致谢

这项工作是由来自西北大学（至Y. W.），NIH Grant R01 GM 067725（至N. L. K.）和国家科学基金会新兴前沿研究和创新1136903（到N. P. K.）的启动和ISEN资助支持的。方案改编自Zheng等人（2015）。

参考文献

Amin，R.，Dupuis，A.，Aaron，S.D.and Ratjen，F。（2010）。使用 Aspergillus fumigatus的慢性感染对肺功能和住院的影响囊性纤维化患者胸部 137（1）：171-176。
Frey-Klett，P.，Burlinson，P.，Deveau，A.，Barret，M.，Tarkka，M。和Sarniguet，A。（2011）。细菌 - 真菌相互作用：农业，临床，环境和食品微生物学家之间的连字符。 Microbiol Mol Biol Rev 75（4）：583-609。
Peleg，A.Y.，Hogan，D.A。和Mylonakis，E。（2010）。医学上重要的细菌 - 真菌相互作用 Nat Rev Microbiol 8（5）：340-349。
Shimizu，K。和Keller，N.P。（2001）。 cAMP依赖性蛋白激酶在调节形态和化学过渡的G蛋白信号转导途径中的遗传参与 Aspergillus nidulans 。 Genetics 157（2）：591-600。
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