材料和试剂

胎牛血清（FBS）
无菌PBS（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：20012-027）
0.17M氯化铵
胶原酶I型（CLS I）（Worthington，目录号：4197，比活性230U mg ^-1）
DMEM，高葡萄糖（Life Technologies，Gibco ，目录号：10313）
多聚甲醛（Tousimis，目录号：1108A）
BSA（级分V）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）
Fc区（CD16/CD32）
FACS染色缓冲液（参见配方）

设备

BD LSRII或类似的流式细胞仪
台式冷冻离心机
BD细胞过滤器（40nm）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352340）
30ml注射器（BD Biosciences，Falcon ，目录号：309661）
显微镜
21G针（BD Biosciences，Falcon ，目录号：305165）
26G针（BD Biosciences，Falcon ，目录号：305111）
V底96孔测定板（Corning，Costar ，目录号：3897）
玻璃玻璃磨砂（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-550-11）

程序

从肾炎小鼠收获肾脏以分析肾脏浸润的程序。
1. 麻醉鼠标和灌注60毫升冷PBS超过3-5分钟通过左心室切断右心房后，观察肝脏和肾脏的苍白色变化。如果需要，用另外60ml冷PBS重复灌注。
2. 小心地将肾脏切除并切成1至2毫米^{3片，不包括任何相邻的肾脏脂肪。}
3. 将切片在含有2mg/ml I型胶原酶（Worthington）的DMEM中在37℃下孵育30分钟（使用每两个肾脏10ml）。
4. 轻轻破碎组织通过吸取上下顺序通过25毫升，10毫升和5毫升移液器获得细胞悬浮液。
5. 将细胞悬浮液通过BD细胞过滤器（70nm）过滤到锥形管中
6. 轻轻擦拭两个载玻片之间的剩余材料，重悬于2ml DMEM中，过滤并加入悬浮液中。
7. 让悬浮液短暂停留（3-5分钟），在此期间大多数较大的碎片沉降到底部。收获包含碎片的底部200μl以外的悬浮液。
8. 在显微镜下检查沉降的细胞，看是否有任何团块。如果是，将沉降的细胞重悬于新鲜DMEM中，过滤并重复步骤6
9. 收集获得的悬浮液，并以1,200rpm离心10分钟
10. 倾析上清液; 在冰上将沉淀重悬于5ml冰冷的氯化铵（0.17M，pH7.2）中5分钟。
11. 加入15ml无血清DMEM。计数细胞以估计悬浮液中总细胞的数量。以1,200rpm旋转5分钟。
12. 重悬细胞在1毫升FACS缓冲液（3％胎牛血清的PBS溶液）。细胞现在可以进行流式细胞分析或进一步的分离程序
通过流式细胞术分析肾浸润的程序
1. 将Fc细胞（CD16/CD32）中的肾脏细胞再悬浮15分钟，将总悬浮液体积调整至约100μl/染色。对于一个全肾最多使用1ml（10个染色剂）。
2. 将细胞相应地分配到96孔V底板（每孔100μl）
3. 加入生物素化的抗体（1/200稀释），轻轻混合并在冰上孵育30分钟。在孵化过程中保持板在黑暗中。
4. 同时，将单一管中的所选抗体的下一个混合物与链霉亲和素荧光染料混合（在FACS染色缓冲液中每种抗体的1/200稀释度）。使用同种型控件包括一组污渍。
5. 为了去除未结合或过量的染色，在温育30分钟后向孔中加入100μl冰冷的PBS。在4℃下以1,200rpm离心板5分钟
6. 通过颠倒板一次而不干扰细胞沉淀来弃去液体。
7. 将步骤4的抗体的混合物加入沉淀（100μl/孔），并使用多通道移液管轻轻地重悬。在冰上再孵育30分钟。
8. 重复步骤5和步骤6.
9. 重悬细胞在200微升2％多聚甲醛，转移和存储在FACS管在黑暗中直到流式细胞仪上获取的时间（24小时内）。
10. 在flowjo软件中对获得的细胞进行分析以鉴定浸润物内的细胞类型及其在肾脏内的百分比。

笔记

肾脏需要用PBS灌注以在处理前除去血液，因为在SLE模型中大量的CD11 ^{b +}细胞出现在血液中。灌注应该从心脏仍然跳动开始，以改善PBS的循环。如果肝脏在灌注后均匀地变苍白，那么除血已经足够了。血液去除也提高了免疫组化的质量。

食谱

0.17M氯化铵
FACS染色缓冲液
PBS
3％FBS

致谢

这项工作是由NY SLE基金会RB和国家卫生研究院RO1 DK085241-01到AD支持。

参考文献

Bethunaickan，R.，Berthier，CC，Ramanujam，M.，Sahu，R.，Zhang，W.，Sun，Y.，Bottinger，EP，Ivashkiv，L.，Kretzler，M.and Davidson，。鼠系统性红斑狼疮肾炎中的独特杂合性肾单核吞噬细胞活化表型。 J Immunol 186（8）：4994-5003。