材料和试剂

真空驱动一次性过滤系统（Stericup0.22μm）（Merck Millipore Corporation，目录号：P25628X1）
量筒（50ml）
Sephadex G-25柱（PD-10）（GE Healthcare，目录号：17-0851-01）
玻璃杆
用于超速离心的厚壁聚碳酸酯塑料管（Beckman Coulter，目录号：355631）
玻璃一次性微量移液管（Corning Inc.，目录号：7099S-20）
Resource Q阴离子交换柱6ml（GE Healthcare，目录号：17-1179-01）
（从2-3升的1.2×10 7细胞/ml光异养培养物中收集的约8g湿重）的细胞。
三（2-氨基，2-羟基甲基，1,3-丙二醇）（Trizma碱）（Sigma-Aldrich，目录号：T-1503）
硫酸镁七水合物（MgSO 4，7H 2 O）（vidraFOC，Panreac，目录号：131404-1210）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O·6H 2 O）（Merck Millipore Corporation，目录号：1.05833）
氯化钠（NaCl）（AppliChem GmbH，Panreac，目录号：121659.1211）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Merck Millipore Corporation，目录号：1.06329）
2-巯基乙醇（Merck Millipore Corporation，目录号：8.05740）
硫酸（H 2 SO 4）（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：84718）
盐酸（HCl）（VWR International，J.T.Baker ，目录号：6081）
蔗糖（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：84100）
cOmplete（蛋白酶抑制剂片剂）（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）
聚（乙烯基聚吡咯烷酮）（Sigma-Aldrich，目录号：P-6755）
硫酸铵[（NH 4）2 SO 4]（AppliChem GmbH，Panreac，目录号：141140）
dH 2 O（去离子水）（由来自Merck Millipore Corporation的Milli-Q系统处理）
考马斯蓝染SDS-PAGE（可选）
提取缓冲液（EB）（参见配方）
蔗糖梯度缓冲液（SGB）（参见配方）
蔗糖密度梯度（参见配方）
色谱缓冲液A（CBA）（参见配方）
色谱缓冲液B（CBB）（参见配方）
激活缓冲区（AB）（参见配方）

设备

配有19 mm高增益探头的超声波处理器（Sonics Vibracell，型号：VCX 500）
光学显微镜（Microscope Central，Nikon，型号：Alphaphot 2 YS2）
磁力搅拌器（Bibby Scientific，Stuart，型号：SB161-3）和磁棒
装备有固定角转子（Beckman Coulter，型号：JA-20）的预制离心机（GMI，Beckman Coulter，型号：J2-HS）
装备有固定角转子（Beckman Coulter，型号：55.2Ti）的超速离心机（GMI，Beckman Coulter，型号：L-70）
两室（2×8ml）梯度混合器（自制）
UV监视器（GE Healthcare，Amersham-Pharmacia Biotech，型号：具有Rec112寄存器的UV-1）
快速液相色谱设备（FPLC）（GE Healthcare，Amersham-Pharmacia Biotech，型号：?ktaPrime）
蠕动泵（GE Healthcare，Pharmacia，型号：P-1）
UV-V分光光度计（Shimadzu Scientific Instruments，型号：UV-1603）
水喷射真空泵（吸气器）（KARTELL SPA VIA DELLE INDUSTRIE，型号：1395）
超声水浴（Scientific Support，Branson，型号：2200）

程序

Rubisco的提取和硫酸铵沉淀
1. Rubisco可以从新鲜收获的培养物中纯化（沉淀 ?通过在2,000×g离心5分钟）或从冷冻丸粒（其通过离心 ?如果立即在液体中冷冻，可以无限期保守氮）。在后一种情况下，冷冻的细胞应该在冰上解冻在具有蛋白酶抑制剂的提取缓冲液（EB）的存在下下一步）。
2. 将约8g（湿重）的细胞沉淀重悬在32ml冰冷的EB（含蛋白酶抑制剂）中。
3. 超声处理细胞悬浮液在冰浴中用6个脉冲（30秒， ?每个，间隔60秒的等待间隔）的19mm高增益探头 ?传送100W。细胞壁破裂的程度可以通过光学显微镜
4. 加入0.64g不溶物将聚乙烯聚吡咯烷酮加入到超声处理的悬浮液中，磁条在冷室（4℃）中5分钟
5. 离心机 25,000×g 在4℃温育15分钟，并收集上清液（避免深绿色层在颗粒的顶部）测量其体积在a 量筒
6. 每毫升加入0.194克固体硫酸铵的上清液（这将使溶液达到35％盐饱和）同时用磁棒搅拌。在冷却下保持搅拌30分钟 ?房间（4℃）。
7. 在4℃下以25,000×g离心10分钟收集澄清的上清液，再次测量其体积在刻度 ?缸。
8. 加入0.151g固体硫酸铵/ml 上清液（以使溶液达到60％盐饱和）在冷室（4℃）中再次搅拌30分钟
9. 离心机 25,000×g在4℃温育10分钟，弃去上清液。重新悬挂 ?沉淀的蛋白质在小于3ml的蔗糖梯度缓冲液（SGB） ?通过与玻璃棒小心混合（不要涡旋，因为这将形成耐久的泡沫）
10. 使溶液体积为5 ml 并加载两个Sephadex G-25（PD-10）脱盐柱（2.5ml 每个）预先在4℃下用SGB平衡。用每个柱洗脱 3.5 ml相同的SGB，最后汇集洗脱液。
蔗糖梯度离心
1. 通过使用双室梯度混合器，准备四个塑料厚壁离心管含有0.2至0.8M的16ml线性梯度蔗糖溶于SGB
2. 分配7 ml脱盐洗脱液在四个16ml蔗糖梯度的顶部并平衡管等于重量。
3. 在4℃下在固定角转子中将管在132,000×g下超速离心4小时。选择慢初始加速度以避免梯度的扰动
4. 后离心，使用玻璃分级每个管的内容物插管（例如，一次性微型移液管）粘在底部管，连接到符合a的有向蠕动泵 UV监视器调整到280 nm（图1）。
  
  图1.超速离心后从蔗糖梯度收集馏分的装配
5. 单独收集出现在2内的不同Rubisco峰并从管的底部取5ml（参见图2）。结合从四个管收集峰，并存储在-20°C冷冻，除非随后立即进行色谱法。梯度馏分可无限期储存在-20℃
  
  图2.典型记录蔗糖梯度在280nm的光密度超速离心后从管的底部收集。 Rubisco（B）的峰侧面是由于核酸的下降吸光度 ?酸（A）和增加吸收的其他（较少重量）蛋白（C）。
阴离子交换色谱
1. 用层析缓冲液A（CBA）稀释从蔗糖梯度获得的合并的含Rubisco的级分三次。
2. 将稀释的级分装载在6ml Resource Q离子交换柱上安装在FPLC系统上并用CBA以2ml/min通量平衡率。
3. 用编程的120以6ml/min的流量洗脱柱子 ml（，20柱体积）线性梯度，范围为0％至42％色谱缓冲液B（CBB）在CBA中，同时监测吸光度 280nm的洗脱液。收集Rubisco，这将洗脱作为一个锋利和在25％的CBB附近的非常强的峰。之后，列可以 ?用100％CBB彻底洗涤，然后用CBA重新平衡用于处理下一个样品。否则请按照制造商列存储的说明。
Rubisco脱盐
1. 将2.5ml收集的Rubisco溶液装载到Sephadex G-25上（AB）平衡的（PD-10）脱盐柱用3.5ml相同的缓冲液洗脱蛋白质。这一步将会消除盐[其在更高的浓度下抑制Rubisco活性 ?比0.2M（Sudhani等人，2013）]，并提供Mg 2+和CO 2 +，其中促进Rubisco的催化能力的构象。

代表数据

最终制剂应含有大于95％的Rubisco蛋白质，其基本上不含核酸（A280/A260比率高于1.9）。可以从假定消光系数ε1％= 15.9dl·g ^-1·cm <-1> 的UV吸光度计算Rubisco浓度。。 Rubisco的典型最终浓度为约1mg/ml 图3说明了通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE确定的纯度。所描述的方案导致高纯度Rubisco，其甚至可以用于酶的结晶。在不需要这种纯度的情况下，可以省略阴离子交换层析（C部分）来缩短方案。在蔗糖梯度离心后，Rubisco已经是提取物中总蛋白的80％以上（见图3B），尽管仍然存在核酸的显着污染。

图3.来自C的Rubisco纯化的考马斯染色的SDS-PAGE分析。 reinhardtii 。箭头表示在14％丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上Rubisco的大（LS）和smal（SS）亚基的位置。 A.纯化的Rubisco（0.25μg，泳道P）的最终制备与分子量（以kDa计）的标记（MM）平行进行。 B.离心后从蔗糖底部收集级分（每次0.7ml）。上面的红色线表示待合并的级分，用于通过阴离子交换色谱法进一步纯化。

笔记

我们已经成功地测试了相同的纯化方案，从从许多其他物种，包括高等植物的叶子（菠菜，水稻，桑树和橙树），叶子的Lemna和Euglena的文化获得的粗提取物。只有当从硅藻种中纯化Rubisco时，硫酸铵馏分必须移动（至0-35％饱和度），以获得更好的产率（Marín-Navarro等人，2010）。

食谱

提取缓冲液（EB）（100mM Tris-硫酸盐，10mM MgSO 4，20mM 2-巯基乙醇，pH8.0）
对于200毫升：
将约2.42g的Tris和0.493g的MgSO 4·7H 2 O 2溶解在约150ml的dH 2/O
用稀释的（例如0.5M）H 2 SO 4 4调节pH至8.0/
使最终体积为200 ml，并在4℃下保存
每50 ml溶解1片蛋白酶抑制剂，在使用前立即加入1.4μl2-巯基乙醇/ml。
蔗糖梯度缓冲液（SGB）（10mM Tris-H 2 SO 4，10mM MgSO 4，10mM NaHCO 3， 1mMβ-巯基乙醇，pH 8）对于200毫升：
将2.42g Tris，0.493g MgSO 4·7H 2 O和0.168g NaHCO 3溶解在二氯甲烷中，约150ml的dH 2 O 2 / 加入140μl的2-巯基乙醇用稀释的（例如0.5M）H 2 SO 4 4调节pH至8.0/
使最终体积为200 ml
对于每个实验，在溶解蔗糖和制备梯度之前不久应该新鲜制备该缓冲液
准备蔗糖密度梯度
对于4个渐变：
0.2M蔗糖溶液：将2.55g蔗糖溶于35ml SGB中 0.8M蔗糖溶液：将9.30g蔗糖溶于28.2ml SGB中用8ml 0.8M蔗糖溶液填充梯度混合器的混合（搅拌）室，辅助室用8ml 0.2M蔗糖溶液填充。
连接两个室，并通过蠕动泵将流出物引导至厚壁超速离心管，使混合溶液沿着壁滴落到管的底部（参见图4）。
重复此过程四次，以在四个独立的离心管中获得四个梯度将冷却室中的温度保持不变（即无振动）数小时或过夜，将梯度冷却至4°C。

图4.准备蔗糖密度梯度
色谱缓冲液A（CBA）（20mM Tris-氯化物，pH7.5）对于1 L：
将2.42g的Tris溶解在约0.8L的dH 2 O中使用稀释的（例如，0.2M）HCl
小心地调节pH至7.5 使体积为1 L，并通过连接到吸气真空泵的灭菌0.22μm一次性过滤系统过滤使用前，在超声波水浴中脱气10分钟（缓缓打开）瓶子
色谱缓冲液B（CBB）（20mM Tris-氯化物，1M NaCl，pH7.5）对于0.5 L：
将1.21g Tris和29.58g NaCl溶于约0.4L dH 2 O中。
使用稀释的（例如，0.2M）HCl
小心地调节pH至7.5 使体积达到0.5升，过滤和除气与CBA一样
活化缓冲液（AB）（100mM Tris-HCl，10mM MgCl 2，10mM NaHCO 3，pH8.2）
对于100 ml：
将1.210g的Tris，0.203g的MgCl 2·6H 2 O，6H 2 O和0.084g的NaHCO 3溶解在约80ml dH 2 O 2 / 使用稀释的（例如，1mM）HCl
将pH调节至8.2 使最终体积为100毫升，并转移到一个100毫升的瓶子，留下很少的顶空。该缓冲液应在使用前不久制备以避免碳酸盐作为CO 2的损失。

致谢

这项工作是由瓦伦西亚大学的赠款（UV-INV-AE14-269247）支持的。该协议是在Sudhani和Moreno（2015）中作为补充信息发布的一个详细和扩展版本。

参考文献

Goldwaithe，J。和Bogorad，L。（1975）。叶中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶 Meth Enzymol 42：481-487。
Marín-Navarro，J.，García-Murria，M.J.and Moreno，J。（2010）。氧化还原性质在Rubiscos中通过不同的模式保存在硅藻和绿藻中的半胱氨酸。 46：516-524
Sudhani，H. P.和Moreno，J.（2015年）。叶绿体谷胱甘肽库控制核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性。 Arch Biochem Biophys 567：30-34。
Sudhani，H.P.，Garcia-Murria，M.J.and Moreno，J。（2013）。由核酮糖1,5-二磷酸羧化酶对CO 2定位的可逆抑制/氧化酶通过亚砷酸盐和单硫醇的协同作用。植物细胞环境36（6）：1160-1170。