材料和试剂

拟南芥种子（Col-0）
Eppendorf管（1.5ml）中
商业污点
移液器和吸头（1和5 ml）
硅帽（或铝箔）
方形培养皿
塑料包装
小铲和镊子
烧瓶（200ml）
塑料包装
玻璃培养管
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P-1379）
Murashige和Skoog培养基（MS）（ Phyto Technology Laboratories ，目录号：M524）
蔗糖（VWR International，目录号：BDH-0308）
氢氧化钾（KOH）（Thermo Fisher Scientific，目录号：P-250）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A-1296）
无菌蒸馏水
MES水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M-8250）
种子灭菌溶液（见配方）
MS实体（参见配方）
MS液体（参见配方）
测定解决方案（参见配方）

设备

高压灭菌器
旋转振动器
流量罩
冰箱（4°C）
植物生长室（Conviron，目录号：ATC26）
磁力搅拌器和搅拌棒
pH计（Beckman Coulter）
注意：pH探针应该能够测量体积<= 3ml的样品的pH。
余额

程序

种子灭菌
1. 将5mg（200-300粒种子）拟南芥种子放入Eppendorf管中，加入750μl灭菌溶液。
2. 在室温下涡旋15分钟
3. 在流动罩下倒出灭菌溶液（无菌尖端），加入750μl无菌水
4. 短暂涡旋。
5. 重复步骤c和d 3次。
6. 将种子在750μl无菌水中在4℃在黑暗中分层2天。
电镀种子（流动罩下）
1. 在无菌固体MS平板上播种种子（约10）。保持密度大约每平方厘米1个种子。拥挤的板材产生不健康苗。
2. 关闭和密封板用塑料套。只使用一个塑料包装层。多于一层防止气体交换 ?健康植物生长
3. 孵育板在垂直位置 ?生长室中在21℃下以12小时光/12小时暗循环（150μmolm -2 -2s -1 s -1）（Forde，2000）。垂直生长减少根部压力并防止移植苗时的琼脂转移
4. 生长幼苗5-7 d。
液体培养基中的植物生长
1. 分别用4ml液体MS制备200ml烧瓶
2. 关闭带"硅"帽（或铝箔）的瓶子。
3. 高压灭菌瓶在121℃下20分钟
4. 让烧瓶在流动罩中冷却。
5. 转移10幼苗到每个烧瓶。把幼苗放在底部在无菌刮铲和镊子的帮助下。确保幼苗 ?保持与媒体接触。
6. 关闭有一层的烧瓶保鲜膜。透明塑料包装有利于透光，促进植物均匀生长，防止培养基蒸发
7. 在旋转振荡器上在50rpm的室中在21℃下用a生长植物 12小时光/12小时暗循环（150μmolm -2 -2s -1 s -1））2周。
8. 工资注意：通常苗前消耗所有液体培养基 2周。在这种情况下，加入4 ml无菌液体MS。
酸化测定
1. 空的烧瓶和洗涤根与测定溶液（5ml）5分钟
2. 再次倒空烧瓶并加入新鲜的测定溶液（3ml）
3. 用测定溶液（3ml）制备对照烧瓶，但不含任何植物
4. 用塑料（透明）箔封闭烧瓶，并将它们保持在生长室中6小时
5. 将所有3ml的测定溶液从烧瓶中转移到玻璃管中，并进行pH测量
6. 从烧瓶中取出植物，并检查每个烧瓶中的植物数量
7. 用纸巾干燥植物，从枝条切根，和立即称重，避免植物脱水，并伴有重量 ?失利。根和茎的重量是重要的值，因为我们可以 ?计算每克根或幼苗释放的质子。
计算
1. 使用来自每个烧瓶的pH值，使用方程pH = -log [H sup + ]计算样品和对照中的[H sup +]（mole/>
2. 计算3ml实验和对照样品中的H sup +摩尔数[摩尔/3ml]。
3. 通过减去平均值来计算粗H + sup + +释放到培养基来自H ⁺ _sample的H ⁺典型的实验需要3 到5个独立的重复
4. 将相对于植物数或根或植物鲜重的H 摩尔的平均数相对。的单位将是摩尔/植物或摩尔/g。这些相对化值允许我们从几个烧瓶计算平均值比较具有不同植物数量或植物品系的烧瓶。

代表数据

图1.通过Col-0（空条）和过量表达IH i + -/- >顶层AVP1（AVP1-1）的转基因植物在白天和夜晚从根部释放的质子，（平均值±SE; n = 6个池，每行10个植物，每次每个时间，每次试验）的植物（黑色条）（黑色条）两次独立试验）

食谱

种子灭菌溶液
30％（v/v）商业漂白剂
0.05％（v/v）Tween-20
Murashige和Skoog（MS）固体
半强度MS
1％[w/v]蔗糖 pH 5.7用KOH
1％[w/v]琼脂
MS液体
半强度MS ⁺
1％[w/v]蔗糖（用KOH调pH为5.7）
测定溶液
四分之一强度的微博
2mM MES缓冲液（pH6.8，KOH）。低MES浓度保证了所有植物的类似的起始pH

致谢

RAG，GAP和KR由国家科学基金会（授权号IOS-1122148）支持。该方案改编自Pizzio等人（2015）。

参考文献

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Hawes，M.C.，Bengough，G.，Cassab，G。和Ponce，G。（2003）。根冠和根际。 J植物生长调节 21：352-367。
Miller，A.J。和Smith，S.J。（1996）。谷类根细胞中的硝酸盐转运和分隔。实验植物学杂志，Vol。 47，No. 300，pp。843-854。
Pizzio，GA，Paez-Valencia，J.，Khadilkar，AS，Regmi，K.，Patron-Soberano，A.，Zhang，S.，Sanchez-Lares，J.，Furstenau，T.，Li，J.，Sanchez -Gomez，C.，Valencia-Mayoral，P.，Yadav，UP，Ayre，BG和Gaxiola，RA（2015）。拟南芥 I型质子泵浦焦磷酸酶在韧皮部中强烈表达，其中是焦磷酸盐代谢和光合分配所必需的。植物生理学167（4）：1541-1553。
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