材料和试剂

带毫米分隔的标尺
玻璃底培养皿（MatTek Corporation，目录号：P35G-1.5-14C）
盖片（1.5,1.07mm厚，22×22）（Thermo Fisher Scientific，目录号12-541B）
移液器1.5 ml
拟南芥植物在开花期
在石蜡浴（Thera-Band，目录号：24050）中在40℃下保持液体状态的无毒食品级石蜡
蒸馏水

设备

光谱物理MaiTai HP钛：蓝宝石锁模脉冲激光，可调波长跨越690至1,040 nm。
奥林巴斯Fluoview 1000扫描头（奥林巴斯美国公司，型号：FV1000MPE）由奥林巴斯修改为双光子成像，包括脉冲激光输入的光路和非减速，多碱性侧窗光电倍增管PMT）。
Olympus BX61WI直立显微镜
奥林巴斯多光子显微镜滤光片（440/40带通滤光片）（OLYMPUS，型号：FV10-MRVGR/XR 4CH NDD FILTER）
奥林巴斯多光子显微镜专用物镜，优化用于传输红外光（25x，1.05数值孔径，2.0毫米工作距离）（OLYMPUS，型号：FV10-SNPXLU）
光密，定制多光子显微镜外壳。为了构建外壳，可以使用铝挤压部件（北美洲项目）和平黑漆纤维板
用于精细解剖的钳子（Electron Microscopy Sciences，目录号：72700-D）
Olympus立体显微镜（倍率范围为6.3-63x）（OLYMPUS，型号：SZX10）

软件

Olympus FluoView FV10-ASW 3.01
光谱物理麦泰控制激光软件
Volocity 6.1.1软件包
注意：ImageJ 1.47v也可以用来处理图像。

程序

学习操作奥林巴斯双光子显微镜或类似系统的新用户应由有经验的用户或技术人员监督。本文描述的协议是特定于奥林巴斯系统，并且应当仅在操作其它双光子成像平台时用作补充资源。

显微镜设置
1. 操作迈泰激光。
  打开激光器电源，调谐激光器到所需的波长并使用Spectra-Physics打开快门 ?麦泰控制（见图1）。虽然激光器可以操作通过FluoView或单独通过Spectra-Physics麦泰控制应用中，建议打开激光器通过 Spectra-Physics应用程序，独立于FluoView软件，以防止在软件故障的情况下激光关闭
  1. 打开激光。
    不使用时，激光器应设置为800 nm（图1，左边） ?面板），并应在此波长下预热（图1，中间图）。选择并按住"ON"以打开激光（图1，左面板）。等待激光开始脉冲（由下面的绿色框指示） '脉冲'）和IR功率电平（由红色条表示）来稳定（图1，中间图）。确保激光脉冲（模式锁定）状态达到。
  2. 将激光调谐到成像波长。
    30分钟激光预热后，红外（IR）功率电平应为稳定。调整激光设置波长从800 nm到720 nm 进入成像波长'720'，'进入'以对激光器进行调谐 ?波长（图1，右图）。确保红外功率达到2.49 当使用720nm和3％激光功率时的瓦特。还要确保正确的720 nm波长输入Fluoview软件采集设置在激光下。
    注意：当您更改激光波长时，IR功率也变化。为了在不同波长处获得一致的发射功率，每次激光波长时必须调整激光功率改变。在FluoView中输入正确的激光波长激光下的采集设置面板。
  3. 打开反射光快门。
    单击关闭（灰色）快门按钮将快门切换到打开（黄色）位置（图1）。手动打开快门显微镜单元，位于滤光轮旁边。
    
    图1.麦泰激光操作通过光谱物理激光控制接口。从左到右：调整激光器参数如图所示打开激光器打开电源并将激光器调谐到所需的波长。从...开始左面板，激光功率关闭并设置为800 nm的前一个 ?用户。选择并按住"ON"以打开激光器。等待激光开始脉冲（由"脉冲"下的绿色框表示）和红外功率电平（由红色条表示）稳定。后充分的激光预热，调谐激光到成像波长 720nm。确保IR电源电平稳定。点击关闭（灰色） ?快门按钮将反射光快门切换到打开状态（黄色）位置。
2. 安装目标。
  选择一个清洁物镜和螺丝固定在显微镜上的位置。为了奥林巴斯FV1000MPE多光子显微镜，XLPLN 25x水浸推荐使用物镜，因为它针对多光子成像进行了优化（图2A）。在FluoView采集中选择正确的目标设置面板，在显微镜下。
3. 筛选多维数据集选择。
  选择Olympus BFP/GFP/RFP/Ds红色滤镜立方体，具有440/40带通过滤器（420-460nm;图2B）。始终处理过滤器立方体手套。将过滤器立方体拧入过滤器立方体腔室内的适当位置位于滤光轮和滑块后面
4. 调整物镜和镜台位置。
  显微镜载物台可以在x轴和y轴上进行调整操纵杆控制（图2C）。为了沿z轴移动物镜，朝向或远离标本，使用对焦遥控器（图2D）。
  
  图2.可调整的显微镜硬件 Olympus XLPlan N 25X W MP物镜，推荐用于多光子成像。 B.奥林巴斯滤镜立方体（FV10-MRVGR/XR 4CH NDD FILTER， BFP/GFP/RFP/Ds红，380-560nm）。 C.舞台控制操纵杆。 D.焦点遥控器
5. 引导光路。
  对于透射光观察或双光子成像，不同的光路配置。对于透射光观察，滑块必须处于向外位置以允许光移动到目镜（图3A），滤光轮应处于DICT位置（图3） 3C）。对于四通道双光子成像，确保两个滑块都在（图3B），并将滤光轮移动到位置2（图3D）。为了 ?奥林巴斯FV1000 MPE系统，滤光轮上的R690位置是意味着双光子成像和DICT位置允许传输光观察。
  
  图3.显微镜配置。A.显微镜滑块处于用于透射光观察的向外位置。乙。显微镜滑块位于向内位置，用于双光子成像在四个通道中进行发射捕获。 C.滤光轮在DICT中透射光观察位置。 D.滤光轮在R690 双光子成像的位置。

标本制备

在花粉发育的自由小孢子阶段选择花药。
1. 使用镊子，从您感兴趣的拟南芥植物中除去花簇（图4A）。丢弃开放的花。
2. 在解剖显微镜下，使用镊子（图4B）从花簇分离每个芽。
3. 对于在自由小孢子阶段的雄蕊，选择0.7的芽到1.2mm（图4B，装在中间一排）。芽测量<0.5mm，0.5-0.7mm通常在其中包含花药小孢子母细胞或花粉发育的四联体阶段，（图4B，见括号花芽簇）。芽测量> 1.2mm通常在晚期阶段包含花药花粉发育，其特征在于花粉和绒毡层退化（图4B，参见括号底芽行）。
  注意：每个雄蕊的发育阶段可以在芽的芽之间变化 ?长度，在一芽内的六个雄蕊，甚至偶尔在同一花药的室之间。由于这些原因，许多花药对于每个感兴趣的基因型应该从多个芽分析确保确定感兴趣的正确阶段。
4. 选择芽大小后，小心地从中去除萼片和花瓣一个感兴趣的芽（图4C）和切除雄蕊进入微孔 ?玻璃底培养皿（图4D）。当处理每个雄蕊钳子，扣住细丝，以避免损伤花药。
5. 盖 ?雄蕊用蒸馏水。轻轻取出所有被困住的气泡 ?在微孔中。为了沿着花药外表面除去气泡， ?用镊子保持每个雄蕊水下，轻轻操纵泡沫远离花药表面。除去所有气泡是至关重要的气泡干扰成像。如果气泡不会消散，不选择花药用于成像。花药准备好成像应该 ?水槽。
6. 丢弃花药，造成任何可见的损坏解剖（例如具有分离的细丝的萎缩的花药，在图4D中圈出）。花药浸没在水中（图4E）与气泡相关的应该被丢弃。
7. 用石蜡沿着所有边缘将样本密封在盖玻片下（图4F）。
  
  图4.雄蕊的选择和成像的准备。拟南芥花芽簇除去开花花。芽尺寸选择。所有 ?显示的芽来自（A）中的花芽簇。右边的标尺描绘了1mm间隔。长度为0.7-1.2mm的芽（中间行， ?boxed），因为它们在游离小孢子中含有花药阶段的花粉发育先于绒毡层程序性细胞死亡。芽 ?长度超过1.2mm（图B中的括号底行）或下面长度为0.7mm（在花簇中，包围在图B中）丢弃。 C.芽显示暴露的雄蕊和心皮，后萼片和花瓣去除。 D.花药从花花中除去之后，之前 ?淹没在水中。花药由解剖造成的损害（如如圆圈的花药缺乏丝和看起来蜷缩）丢弃。 E.将花药浸没在蒸馏水中，低于石蜡密封盖玻片。与气泡相关的花药不成像。 F。 ?将盖住微孔和浸没的花药的盖玻片密封所有方面的培养皿用石蜡。
样品装载和校准。
将大水滴放在样品盖玻片上并放低物镜直到其被部分浸没。装上滤光轮到DICT位置用于透射光。转动透射光灯（在FluoView下的图像采集控制下）并拉动两者显微镜滑块到向外位置以允许光移动到 ?眼睛。使用舞台控制操纵杆和对焦遥控器控制器（图2C），以您的感兴趣区域为中心，并带来您的标本成焦点。关闭透射光并移动过滤器轮到位置2（R690）用于双光子成像。
进入双光子成像模式。
在FluoView程序的图像采集控制面板中，选择染料 ?列表菜单。在选择"Two Photon"之前，从列表中清除所有染料。
检查光路。
对于感兴趣的通道中的发射捕获，移动SDM570 二向色镜进入光路进行四通道成像两个显微镜滑块向内。这种配置允许发射从通道1-4（RXD1-4，图5）收集。在Quilichini等人 al。（2014）研究，羟基肉桂酸的排放和相关在420-460的低波长发射范围内收集化合物 ?nm（在RXD1），而叶绿素和相关化合物的排放收集在更高的波长，从495-540 nm（在RXD2）。
注意：该协议中描述的双光子显微镜系统包括a ?在PMT前面没有针孔的单独的非转换光路。 ?然而，在其他系统上打开双光子成像的针孔可能需要常规的共焦能力。

图5。用于在Olympus FV1000MPE多光子上进行双光子成像的光路显微镜。用于成像花药的正确光路自发荧光，检查激光路径（由黄线描绘）在图像采集控制面板的光路和染料窗口中 ?包括在720nm的激光单元3，激发二向色镜， RDM690，以及正确的发射捕获通道RXD1和RXD2
图像采集参数。
在Fluoview中，通过选择启用两个感兴趣的发射通道 RXD1和RXD2在图像采集控制窗口内。扫描期间和图像采集，实时查看窗口可以配置为显示 RXD1和RXD2发射，或这些信道的覆盖。不同通过实时查看窗口可以显示伪色选项在LUT下。推荐使用Hi-Lo显示功能，因为它提供关于成像区域上的发射强度的信息。使用这种显示，曝光过度的像素会出现红色，而曝光不足，昏暗的像素显示为蓝色。激光功率和通道电压设置，如详细在下面的协议中，被选择以最大化信号来自发育中的花药内的细胞类型的混合物的强度，同时避免样品破裂和像素饱和。
最小化样品损坏。
对准期间，使用快速扫描（称为对焦x 2或对焦x 4）对齐您的样品，而不会导致显着的样品漂白。使用xy扫描功能收集图像以收集单个帧图片。要收集z堆栈，请为您的开始和结束z位置设置感兴趣的样品，通常围绕一个花药室，具有1μm ?步长。通过选择深度（在xy扫描下）捕获z-stack 函数），然后单击xy扫描。
最大限度减少光污染。
双光子系统中的检测器不受针孔保护，如在常规的共聚焦显微镜，以确保所有的光在焦点体积。为了最小化从外部光源收集的光， ?通过密封显微镜确保房间照明最小化在不透明的外壳内，在暗室中执行成像，以及在黑暗视图中操作Fluoview程序

拟南芥花药的最佳成像参数。
有关采集设置和图像采集，请参见下表控件。当使用不同的放大倍数时，建议使用 ?相应地调整宽高比，以保持像素大小接近到0.2μm/像素。

激光功率	3％
激光波长（红外功率）	720 nm（2.49 W）
扫描模式	XY
扫描方向	单程
图片大小（宽高比）	800 x 800像素（1：1）
缩放	3x
像素大小	0.212μm/像素
像素驻留时间	4.0μs/像素
Z堆叠步长	1.0微米
集成类型	卡尔曼线平均
整合计数	3
RXD1 HV，Gain，Offset	650 V，1，无
RXD2 HV，Gain，Offset	650 V，1，无

校正深度处的亮度。
改善位于深层下方的荧光团的排放捕获表面，激光功率或高电压（HV，其控制施加在PMT上的电压，采集后）可以调节不同的z位置（深度）。这可以是一个有用的工具，特别对于有价值的信息位于深处的大样本。虽然此功能可用于成像模糊样本或腔位于大深度，耗时，可引起试样如果激光功率设置太高则破裂，并且最佳设置结束 z系列通常是样品特异性的。为了一致性并且因为感兴趣的另一组织足够亮 ?没有这些调整，这个校正不适用于成像在我们的研究（Quilichini等人，，2014）。
图像处理。
将每个图像或z-stack保存为.oif文件，以便在Volocity v ?6.1.1，或将图像序列导入装有ImageJ的ImageJ Bio-Formats插件（Abramoff等人，2004; Linkert等人，2010）。图片 ?处理通常包括对来自的发射应用伪色 ?每个通道，将通道叠加到一个合并的图像或堆栈中，以一致的方式调整亮度和/或对比度，添加缩放条，或者从z-stack创建z投影。
仪器关闭。
成像后，将激光器返回到800 nm，然后关闭激光器功率。在显微镜和通过使用的软件关闭快门 ?以操作激光器。将物镜移动到最高位置在关闭Fluoview程序之前。

笔记

鼓励读者参考奥林巴斯显微镜资源中心（链接下面）关于多光子荧光显微镜的理论和应用的进一步信息。
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/multiphoton /multiphotonintro.html

致谢

我们感谢不列颠哥伦比亚大学生物图像设施，特别是Kevin Hodgson，提供培训，技术援助和讨论。这项工作是由加拿大自然科学，工程研究委员会（NSERC）发现补助和墙上工作NSERC创建程序的支持。该方案用于拟南芥中花粉壁形成的研究（Quilichini等人，2014）。

参考文献

Abramoff，M.D.，Magalhaes，P.J.and Ram，S.J。（2004）。 ImageJ的图像处理。 Biophotonics International 11（7）：36- 42.
Linker，M.，Rueden，CT，Allan，C.，Burel，JM，Moore，W.，Patterson，A.，Loranger，B.，Moore，J.，Neves，C.，Macdonald，D.，Tarkowska， A.，Sticco，C.，Hill，E.，Rossner，M.，Eliceiri，KW和Swedlow，JR（2010）。元数据重要：可访问现实世界中的图片数据 Biol 189（5）：777-782
Olympus FV1000 MPE显微镜用户指南。
Quilichini，T. D.，Samuels，A.L。和Douglas，C.J。（2014）。 ABCG26介导的聚酮化合物运输和羟基肉桂酰基spermidine促成拟南芥中的花粉壁外壁形成，植物细胞 26（11）：4483-4498。