材料和试剂

闪烁瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：03-337-20）
高压灭菌1.7ml微量离心管（BioExpress，目录号：C-3262-1）
试管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-955E）
15ml锥形螺旋盖管（BioExpress，目录号：C-3394-2）
霍乱弧菌经典生物型菌株O395
14亚麻油酸（PerkinElmer，目录号：NEC501050UC）
闪烁混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：SX18-4）
胰蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，目录号：B211705）
酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，目录号：B288620）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP358-212）
氯化钾（KCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP366-500）
磷酸钠（Na 2 HPO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP332-500）
磷酸钾（KH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP362-500）
Tris-Base（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-500）
95％乙醇（Decon Labs，目录号：2805HC）
干冰
LB-Lennox（pH 6.5）（参见配方）
10x PBS（请参阅配方）
20 mM Tris-Base（pH 8.5）（参见配方）
500 mM NaCl（见配方）

设备

能够在37℃下以200rpm振动的振荡器（VWR International，New Brunswick Scientific，型号：Excella E25）
能够在30℃以200rpm振动的水浴摇动器（VWR International，New Brunswick Scientific，型号：Classic C76）
LS6000IC液体闪烁计数系统（Beckman Coulter）
计时器
高压灭菌器
Biomate 3S分光光度计 - 能够在OD 600（Thermo Fisher Scientific）读数
半微型比色杯（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-955-127）
台式离心机 - 能够在4℃以15,000rpm旋转（Eppendorf，目录号：5424）
微量移液器（1000μl，200μl，20μl）
250ml锥形瓶

程序

[14 C]亚油酸吸收量
1. 使用一个殖民地的 V。霍乱菌经典生物型菌株O395启动在含有5ml标准LB的试管中于37℃过夜培养和200rpm摇动
2. 过夜生长后，继代培养细菌在10ml LB pH6.5（1:40比例）中的250μl在锥形瓶中，并在30℃的水浴摇动器中生长2小时。
3. 在2小时，记录培养物的OD <600>。期望OD <600> 在0.2和0.3之间。
4. 转移培养到15毫升falcon管，加入0.1μCi（1微升）的每一毫升传代培养物中的14 C-放射性标记的亚油酸（终浓度约3.2mM亚油酸）。这管可以留下在实验期间的台面上，或者如果需要，放置在37℃，在等分试样之间无搅拌
5. 加入后 ?放射性标记的亚油酸，提取1ml培养物并立即 ?在1.5ml微量离心管中以15,000rpm离心3分钟室内温度。这是t = 0。为了比较每个计数在上清液和细胞沉淀中的14分钟（CPM），转移 ?上清液在1.5ml管中，并用1ml洗涤细胞沉淀3次 ?的1x PBS，并各离心3分钟
6. 重悬细胞在100μl的1×PBS中沉淀，并加入5ml闪烁混合物 ?闪烁瓶。为了比较放射性标记的14 C的量亚油酸不被V吸收。霍乱菌，加入100μl上清液 ?部分与另一个小瓶用5ml闪烁混合物
7. 的可以对其他等份的亚文化重复相同的程序时间5,15和30分钟或任何期望的时间点。所有闪烁瓶可以在室温下储存并一起阅读最后一个时间点后。
8. 摄取后，使用闪烁计数系统测量每个时间点的每分钟计数
9. 然后使用从细胞沉淀物确定的cpm分析数据 ?分数和最佳拟合方程。为了确定多少14 C-放射性标记的亚油酸没有被用作精确度检查，使用从上清液部分确定的cpm并乘以10 仅使用100μl的1ml。放射性标记的14 C的量在每个时间点，细胞沉淀中的亚油酸被绘制在下面：
  
  图1. ¹⁴ C-放射性标记的亚油酸的摄取。霍乱。最佳拟合方程为y = 24622 + 156786 *（1-e <-0.036x ），其中R ^{2的值为0.989。}
分馏。霍乱以确定[14 C]亚油酸的定位。
1. 在如步骤A1中所述在37℃下过夜生长后，继代培养。霍乱菌O395经典生物型250μl在10ml LB（pH 6.5）（1:40比例） ?并在30℃的水浴摇床中生长2小时。
2. 在2小时，添加将0.1μCi的14 C放射性标记的亚油酸加入1ml的传代培养物中，在室温下孵育1小时，无需搅拌。这一次是选择以确保细菌仍处于对数期生长
3. 通过在室温下离心（15,000rpm）收获细菌处理3分钟，并用1ml 1x PBS以15,000rpm洗涤沉淀三次 ?每次3分钟。
4. 将细菌重悬在500μl溶液中 ?的20mM Tris-Base（pH8.5）和500mM NaCl。冻结悬浮液乙醇（至少95％）和干冰浴2分钟，确保管完全浸没，然后置于37℃直至解冻。重复此操作 ?冻融过程共进行三次冻融循环，以确保完全分馏。
5. 分馏细菌在4℃下以15,000×g离心10分钟以分离膜 ?和细胞质。将细胞质作为上清液和沉淀 ?（细胞包膜级分）在500μl的1×PBS中洗涤3次在15,000×g离心3分钟。期待一个非常小的丸底部。每个级分中的14 C-亚油酸的量通过将全部级分加入到5ml闪烁混合物中来测定， ?然后在闪烁计数器中测量CPM
6. 然后将数据分析为每个级分中的14 C-亚油酸的百分比。代表图如下所示：
  
  图2.细胞质和包膜部分中14 C-放射性标记的亚油酸的百分比

食谱

LB-Lennox（500ml）（pH6.5） 5克胰蛋白酶
2.5克NaCl 2.5g酵母提取物
加入约400ml水溶解并混合组分
用HCl将pH调节至6.5，用水调节至500ml 使用前高压灭菌
10x PBS（1L）
80克NaCl
2克KCl
14.4g Na 2 HPO 4
2.4g KH 2 PO 4 4/
使用时，稀释1:10（例如10ml用高压灭菌水加至100ml）
20mM Tris-碱（pH8.5）（100ml） 0.24克Tris-碱
用HCl调节pH至8.5，用水调节至100ml 使用前高压灭菌
500mM NaCl（100ml） 2.92g NaCl

致谢

该工作由P.H.S.支持，授予K22AI071011和R56AI093622以及Bill和Melinda Gates基金会授予OPP1068124（授予J.H.W。）。
这项工作是从我们实验室以前的工作（Thomson和Withey，2014）修改的。

参考文献

Plecha，S.C。和Withey，J.H。（2015）。通过不饱和脂肪酸组分抑制霍乱弧菌的机制 ToxT活性of bile。 J Bacteriol 197（10）：1716-1725。
Thomson，J. J.和Withey，J. H.（2014）。碳酸氢盐增加霍乱弧菌毒素ToxT与毒力基因启动子的结合亲和力。 J Bacteriol 196（22）：3872-3880。